【摘 要】
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[目的]本文通过设计体内外实验,旨在阐述miR-125b-5p在肺腺癌增殖及转移中的作用。[方法]1.qRT-PCR检测miR-125b-5p在肺腺癌细胞系（XWLC-05、SPC-A1、A549、H1299、95-D）,与正常人支气管上皮细胞HBE中的表达水平,选取miR-125b-5p表达水平最高的人肺腺癌细胞系用于构建稳转细胞系。2.构建miR-125b-5p mimic、miR-125b-
【基金项目】
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国家自然科学基金云南省重点联合项目（No.U1702283）；
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[目的]本文通过设计体内外实验,旨在阐述miR-125b-5p在肺腺癌增殖及转移中的作用。[方法]1.qRT-PCR检测miR-125b-5p在肺腺癌细胞系（XWLC-05、SPC-A1、A549、H1299、95-D）,与正常人支气管上皮细胞HBE中的表达水平,选取miR-125b-5p表达水平最高的人肺腺癌细胞系用于构建稳转细胞系。2.构建miR-125b-5p mimic、miR-125b-5p inhibitor慢病毒质粒,经过转染筛选获得miR-125b-5p过表达和沉默表达的细胞系以及空载体,分别命名为miR-125b-5p mimic、miR-125b-5p inhibitor、Neg control,通过qRT-PCR检测转染效率。采用MTT法观察各组细胞增殖活力的变化;通过细胞侵袭实验（Cell invasion assay）检测各组细胞的体外侵袭能力的变化;通过迁移实验（Cell migration assay）检测各组细胞的体外迁移能力的变化;通过细胞克隆形成实验（Cell clone formation assay）,通过计数得出克隆形成个数,检测各组细胞的增殖潜力;通过细胞凋亡实验（Apoptosis assay）,检测各组细胞凋亡细胞的形态特征;3.构建肺腺癌骨转移瘤裸鼠动物模型,通过体内实验验证miR-125b-5p在肺腺癌骨转移中的作用。实验前分别采用心脏注射、尾静脉注射、原位注射的方法接种miR-125b-5p mimic细胞,对三种实验方法进行评估裸鼠成瘤能力。综合评估后采用原位注射的方法进行后续实验。实验分为两组:miR-125b-5p mimic组与Neg control组,采用原位注射的方法接种细胞,每3天进行称重,7周后行X线摄片后,统一处死,称重并拍照,解剖原位成瘤病灶及骨转移灶,通过对监测体重、比较原位成瘤病灶大小、对比骨转移病灶个数等方法评价miR-125b-5p在肺腺癌骨转移中的作用。[结果]（1）qRT-PCR结果显示:与正常人支气管上皮细胞相比,miR-125b-5p在XWLC-05、SPC-A1、A549、H1650、95-D肺腺癌细胞中呈显著性高表达,且在A549细胞系中表达量最高。（2）我们成功构建了 miR-125b-5p过表达与沉默表达的A549稳转细胞系,通过病毒滴度测定检测细胞转染效率,过表达组、沉默组及对照组的转染效率均达到 90%以上。qRT-PCR 结果显示:与 Neg control 组相比,miR-125b-5p mimics组的miR-125b-5p表达水平显著升高（P<0.05）,miR-125b-5p inhibitor组中miR-125b-5p的表达水平显著下调（P<0.05）。（3）MTT实验结果:与Neg control组相比,miR-125b-5p mimic组细胞生长最快,miR-125b-5p inhibitor组细胞生长最慢,且都具有统计学差异（P<0.05）。（4）细胞侵袭和迁移实验结果显示:与Neg control组相比,与miR-125b-5p mimic组,促进了 A549细胞的侵袭和迁移能力,而miR-125b-5p inhibitor组,抑制了A549细胞的侵袭和迁移能力,具有统计学差异（P<0.05）。（5）细胞凋亡实验结果显示:与Neg control组相比,miR-125b-5p mimic组,抑制了 A549细胞凋亡;而miR-125b-5p inhibitor组,促进了 A549细胞的凋亡。（6）克隆形成实验结果显示,miR-125b-5p mimic组细胞形成的克隆小体的数量显著高于miR-125b-5p inhibitor组及Neg control组,具有统计学差异（P<0.05）。（7）体内实验结果提示:与Neg control组相比,miR-125b-5p mimic组的原位成瘤病灶瘤体质量显著增大（P<0.05）,骨转移病灶明显,解剖后经病理验证为肺腺癌骨转移病灶。[结论]（1）成功建立了 miR-125b-5p过表达、沉默表达的A549细胞株,为后续miR-125b-5p功能及分子机制研究提供细胞模型;（2）通过体外功能实验发现:与Neg control组,miR-125b-5p过表达能够促进A549细胞的增殖能力、侵袭迁移能力,miR-125b-5p沉默表达促进A549细胞的凋亡等。这些结果提示:miR-125b-5p在肺腺癌中可能是一种潜在的促癌因子。（3）通过体内实验进一步验证了 miR-125b-5p过表达在肺腺癌骨转移中的作用。与体外实验结果一致,miR-125b-5p过表达能够显著促进肿瘤的原位成瘤和远处骨转移的能力。综述所述,本文有望为后续深入研究miR-125b-5p基因在肺腺癌骨转移中的生物学行为及其机制奠定基础,并为miR-125b-5p靶向治疗肺腺癌骨转移提供理论依据。
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