近年来,随着生物信息学和分子生物学实验技术的发展,目前已发现大量的微小RNA(microRNA或miRNA),其作用遍及生命体的发生、生长、发育、分化、信号转导、疾病和死亡的过程。对miRNA的研究已经从识别miRNA、阐明其作用机制,转移到鉴定其功能。尤其在肿瘤的研究中,miRNA成熟体或前体序列的表达异常直接影响肿瘤发生,发展及分化程度。因此,miRNA对肿瘤的研究非常重要。miRNA是一类长约18-24 nt的非编码调控单链小分子RNA。在大多数情况下,miRNA通过与靶目标的3’非编码区的多个结合位点发生不完全互补,而在翻译水平上负调控靶基因的表达;当miRNA与其靶目标发生完全互补时,也可以特异性地切割其靶基因。miRNA作为真核生物体内重要功能的重要调节因子,近年来在动物和植物中被广泛研究。随着实验方法和生物信息学的进展,越来越多的miRNA被克隆出来,但是在各个物种中所鉴定的miRNA的数量远远不及其理论上的饱和值,所以对miRNA的分离鉴定依然是miRNA研究的一个热点方向。近来的一些研究报告表明,miRNA与癌症发展有关。尽管肿瘤标记物极大地促进了临床诊断和治疗,但是,在灵敏度和特异性上与临床应用的要求依然有很大的差距。无创肿瘤标记物的研究是目前肿瘤研究领域中的一个热点。对血清/血浆标记物的研究在肿瘤诊断研究中更是热点中的焦点。最近,美国弗雷德哈钦森癌症研究中心报道:癌细胞释放一种有效调控基因表达并进入血液循环的重要分子—miRNA,因此血清miRNA就成为肿瘤检测研究工作的重点。为了进一步认识血清miRNA、阐明其作用机制及其功能,为血清标记物的研究提供科学依据,分离纯化并获得血清miRNA是至关重要的。本课题的研究目的是探索分离提取和鉴定肝癌血清miRNA的方法,为建立肝癌血清miRNA的表达谱和探索肝癌血清标记物在肿瘤无创诊断和治疗中的应用奠定基础。方法:1.以人肝癌血清作为材料,采用4种分离提取试剂提取肝癌血清总RNA或者小分子RNA(指分子量≤200 nt的RNA),选择最佳提取方法;2.在miRNA 3’和5’端添加接头并采用RT-PCR扩增的方法制备miRNA的cDNA文库;3.将miRNA的cDNA文库扩增并与T载体连接,转化到E.coli JM109,挑取阳性菌落,并进一步测序鉴定。结果:1.本文分别采用4种不同的提取试剂来获取血清的miRNA,以比较各种提取试剂的优缺点,来选择提取血清miRNA的最佳试剂。但结合不同试剂本身的特征及实验的前期操作,可知,各种试剂都有其适用范围。同位素放射自显影检测结果显示其中三种试剂提取到的血清小分子RNA(指分子量≤200 nt的RNA)的条带均不太清楚。2.将已知小核酸片段与3’端和5’端的接头连接,并将连接产物转化到E.coli JM109中,通过交错PCR法检测及测序,结果显示,3’端和5’端的连接子与已知小核酸片段连接成功。表明该连接方法合理可用,可将此方法应用到肝癌血清miRNA与3’端和5’端连接子的连接中。3.本研究采用交错PCR的方法来筛选肝癌血清miRNA连接产物的阳性克隆,并对其进行测序,测序结果说明阳性克隆中均含有目的片段。同时,用组合引物法确定基因片段插入方向的结果与测序结果是一致的,进一步证明交错PCR法筛选和鉴定阳性克隆的可靠性。4.肝癌血清miRNA与3’端和5’端的接头连接、克隆检测和测序结果显示,连接、克隆和转化成功,插入的片段为4-5个碱基。结果分析:本研究中肝癌血清miRNA与3’端和5’端连接子的成功连接,以及克隆转化和鉴定的结果均表明实验操作技术和方法的合理性,也为进一步研究分离克隆血清miRNA提供了科学依据。然而获得的miRNA片段的大小与我们所预期的有差异,可能原因是血清miRNA与提取试剂不配套。目前试剂公司主要开发的是针对动植物组织中miRNA的提取,还没有专门针对血清miRNA的提取试剂。此外,导致实验结果与期望的结果不理想的原因还有:①成熟的miRNA是以miRNA/Ago蛋白聚合体的形式存在;②单独的miRNA极易降解;③血清中的miRNA的含量特别少;④血清中大量RNA酶可能使miRNA丢失或降解。因此,这些原因为肝癌血清miRNA的提取和分离检测带来了一定的困难。