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本文以黄泥螺为研究对象,围绕黄泥螺内脏体系中多糖展开研究。通过单因素实验和正交试验确定了最佳的提取工艺和纯化方法。最佳提取工艺条件为:提取温度80℃、浸提时间4h、NaOH浓度为0.5mol/l、乙醇与溶液液的体积比为3:1。最佳纯化方法为:两次醇沉结合双酶解法实现多糖的有效分离,TCA法和Sevag法先后使用达到粗除和尽除蛋白的目的,最后用DEAE弱阴离子型纤维素柱对复合多糖进行最后纯化。利用G100葡聚糖凝胶过滤法对复合多糖进行筛分,获得三种不同分子量的多糖:BEP1、BEP2、BEP3,其重均分子量分别为62,185 Da,46,057 Da和21,747 Da。含量分别为32.15%,19.48%和48.37%。醋酸薄膜电泳法检测表明所得三种多糖均为单一多糖。
采用高效毛细管电泳法(HPCE)确定了三种多糖的单糖组成,通过红外光谱、高碘酸氧化、Smith降解和核磁共振方法,分析得到了主要官能团和糖苷键信息。其中,BEP1主要由鼠李糖,葡萄糖,甘露糖,阿拉伯糖,岩藻糖和半乳糖组成,其组成含量(%)比为36:6:14:34:5:5;其中,鼠李糖或(和)阿拉伯糖以1→3糖苷键连接构成多糖主链,可能存在较多支链且支链上单糖残基多以1→2、1→4和1→6糖苷键形式存在;含有α-和β-两种构型的吡喃糖,且以β-型吡喃糖为主。BEP2主要由甘露糖,阿拉伯糖,岩藻糖和半乳糖组成,其组成含量(%)比为47:22:16:15;由甘露糖或(和)岩藻糖以1→3糖苷键连接构成多糖主链,基本上不含1→2和1→4糖苷键;可能存在较多支链且支链上单糖残基多以1→6糖苷键形式存在;含有α-和β-两种构型的吡喃糖。BEP3主要由鼠李糖,葡萄糖,甘露糖,阿拉伯糖和岩藻糖组成,其组成含量(%)比为35:8:39:11:7;其中,甘露糖多以1→3糖苷键、部分单糖残基以1→2糖苷键连接构成多糖主链,基本上不含1→4糖苷键;基本不含支链或支链很少。
对三种泥螺多糖的生物活性进行研究,结果证明,三种泥螺多糖都具有不同程度的还原性、去超氧阴离子活性和去羟自由基活性,且随多糖浓度的增加而增大。尤以BEP1和BEP3去自由基活性最强,在较低浓度下(50μg/ml),便表现出很好的清除羟自由基能力,清除率均在20%左右。三种泥螺多糖中,BEP3具有抑制B-16黑色素瘤细胞、Bcap37乳腺癌细胞、SW1990胰腺癌细胞和HeLa宫颈癌细胞生长的作用,IC50分别为31.08、135.26、172.63、147.52μg/ml,特别是对B-16黑色素瘤细胞显示了将强的生长抑制活性。三种多糖都具有不同程度的抑制黑色素生成的作用,以BEP3效果最佳,在20μg/ml时,抑制率可达4.12%。三种多糖都表现出明显的胞内或胞外酪氨酸酶抑制活性,对胞外酪氨酸酶活性的抑制,以BEP3活性最强,600μg/ml时抑制率可达41%,为熊果苷活性的80%。对胞内酪氨酸酶活性的抑制,三种多糖的活力顺序为BEP1<BEP2<BEP3。其中,BEP3的活力约为熊果苷的50%。