第一部分慢性HBV感染者体内BAFF表达情况的研究研究背景:乙型肝炎(乙肝)是全球最常见的传染病之一,据WHO估计,目前感染过乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的人约有20亿,超过3.5亿人为慢性感染,其中75%发生在亚洲。我国是乙型肝炎的高发地区,2002年全国3岁以上抽样人群HBsAg阳性标化率9.09%,HBV感染标化率50.04%。估计我国慢性HBV感染者约为1.2亿,每年因HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌等相关死亡估计约为30万例,占传染病死亡第一位。HBV感染后在体内是被清除还是形成持续性感染,主要取决于宿主的免疫应答。近年来认为细胞因子在决定HBV感染结局中可能起着非常重要的作用。CD4+T细胞能分泌多种细胞因子,研究认为CD4+T细胞在对HBV的免疫应答中起核心作用。根据产生的细胞因子的类型和生物学功能,CD4+T细胞(Th)至少可以分为Th1、Th2和Th0三类亚型。Th1细胞产生IL-2、IFN-γ、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)等细胞因子,主要参与细胞介导的免疫反应;而Th2细胞分泌IL-4、IL-10、IL-13等细胞因子,主要促进体液免疫反应;Th0细胞则为Th1/Th2的前体细胞,同时分泌低水平的Th1/Th2型细胞因子。近年来,从Th1/Th2细胞来研究乙型肝炎的发病机理备受关注,研究认为HBV抗原特异性的Th1细胞占据优势多发生自限性感染,而Th2细胞多与HBV感染的慢性化有关。近年来病毒性肝炎自身免疫现象引起许多研究者的关注,大量研究表明几乎所有的嗜肝病毒包括HAV、HBV、HCV、HEV以及EBV均可诱发机体的自身免疫,主要表现为血清中检出各种自身抗体,国内报道的HBV感染者自身抗体总阳性率18.80%～61.3%,由于病例选择不同和自身抗体检测项目不同,所报道的总阳性率亦不同,但都证实CHB患者体内存在多种自身抗体,自身免疫紊乱加重了肝细胞的破坏,从而引发肝炎进行性加重。有研究认为Th1/Th2比例失调与自身免疫紊乱有关,致病性Th1可导致组织特异性自身免疫性疾病,而Th2主要介导过敏反应和哮喘。干扰素(interferon)是第一个获准治疗慢性乙型肝炎抗病毒治疗的药物,上市已20余年时间,总体是安全的。但随着干扰素临床应用的日益增多,在治疗过程中出现的一些不良反应也日益引起关注,比如可导致自身抗体出现,特别是基础水平就偏高的患者,随着应用干扰素增强机体免疫功能的同时,患者的自身抗体滴度有可能会逐渐升高,导致治疗效果不佳,甚至引起自身免疫性疾病。B淋巴细胞刺激因子(BAFF)是Shu等于1999年首先发现并克隆的一种新的细胞因子,是肿瘤坏死因子(TNF)家族的第13位成员。BAFF在B细胞和浆细胞活化、CD154(CD 40L)非依赖性抗体类别转换、GC的形成以及非依赖性T细胞和依赖T细胞的抗体应答方面发挥重要作用,能够增强B细胞、CD4+T淋巴细胞以及NK细胞的功能,使机体的免疫应答增强。BAFF激活T淋巴细胞,使CD4+和CD8+T细胞呈现活化状态,尤其可刺激T细胞分泌Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2,因而,BAFF可调节Th1/Th2细胞因子表达比例失调。BAFF缺乏可导致免疫功能低下,过量表达又可导致自身反应性B细胞的大量出现。大量实验表明:BAFF过表达与系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)及自身免疫性肝病等自身免疫疾病的发生和发展有关,与HCV、HIV等病毒感染性疾病有关,但BAFF在HBV感染中的表达情况尚不清楚。总之,HBV感染后在体内被清除还是形成持续感染与机体的免疫应答强度、免疫应答类型密切相关。而大量研究表明细胞因子在HBV感染结局中可能起着非常重要的作用,Th1/Th2型细胞因子表达比例失调被认为HBV感染慢性化的原因之一。肿瘤坏死因子BAFF参与B、T淋巴细胞的免疫调节,在体液免疫中发挥着重要作用,表达不足常导致自身免疫缺陷性疾病,而表达过强又常诱导多种自身抗体的产生,与多种自身免疫性疾病有关。近来研究发现BAFF可特异性激活T淋巴细胞,促进Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2等表达,可能在维持Th1/Th2平衡中有重要作用。因而,本研究以Th1/Th2型细胞因子IFN-γ、IL-10及肿瘤坏死因子BAFF为研究对象,探讨HBV感染后机体的免疫情况。研究目的1、检测HBV感染者不同状态下体内白细胞介素-10(IL-10)、干扰素-γ(IFN-γ)及B淋巴细胞刺激因子(BAFF)的表达情况,探讨HBV感染者机体的免疫情况;2、比较慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者经a-干扰素治疗前后体内IL-10、IFN-γ及BAFF的表达情况,探讨a-干扰素治疗对机体免疫应答的影响;3、比较干扰素抗体阳性和阴性的CHB患者体内IL-10、IFN-γ及BAFF的表达情况,探讨干扰素抗体产生对机体免疫应答的影响。研究方法清晨空腹收集20例慢性无症状乙肝病毒携带者(AsC)、10例干扰素抗体阳性和10例干扰素抗体阴性、20例慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者干扰素治疗前、治疗3个月和治疗6个月及20例健康人(HE)的血清,采用酶联免疫吸附法检测血清IFN-γ、IL-10及BAFF表达水平。研究结果1、HBV感染者细胞因子的表达情况:CHB患者、AsC患者IFN-γ表达水平降低,CHB患者下降最为显著,与健康人有显著性差异(P=0.04);而IL-10水平升高,CHB患者升高最为明显,与健康人有显著性差异(P=0.02);IFN-γ/IL-10比值显著低于健康人,CHB患者降低最为显著,明显低于AsC患者、健康人(P=0.02,0.00);BAFF表达水平有降低趋势,AsC患者下降最为显著,与健康人有显著性差异(P=0.01)。可见HBV感染者存在Th1/Th2型细胞因子表达比例失调,CHB患者失调程度重于AsC患者,BAFF表达水平下降可能与HBV感染慢性化有关,AsC患者降低最为显著;2、干扰素治疗对细胞因子表达的影响:经干扰素治疗后CHB患者IFN-γ表达水平升高,治疗6月时IFN-γ表达水平显著高于治疗前和治疗3月时(P=0.00,0.04),与健康人已无统计学差异(P=0.20);IL-10表达水平有下降趋势,但治疗前后无明显统计学差异(P＞0.05);IFN-γ/IL-10比值随治疗时间延长逐渐上升,治疗后较治疗前有显著升高(P=0.04,0.00),但仍低于健康人(P=0.00);干扰素治疗前后BAFF表达水平无明显变化(F=0.71,P=0.55)。可见干扰素治疗可增强Th1型细胞因子IFN-γ表达,而减弱Th2型细胞因子IL-10的表达,改善Th1/Th2细胞表达比例失调,对BAFF影响不明显。3、干扰素中和抗体(NAb)产生对细胞因子表达的影响:NAb阳性患者IFN-γ表达水平低于阴性患者及健康人,但三组间无明显统计学差异(F=2.93,P=0.07);NAb阳性患者IL-10表达水平高于NAb阴性患者,并显著高于健康人(P=0.00),三组间有显著性差异(F=7.51,P=0.00);NAb阳性患者IFN-γ/IL-10比值显著低于Nab阴性患者及健康人(P＜0.05);NAb阳性患者BAFF表达水平高于NAb阴性患者而低于健康人,三组间无明显统计学差异(F=0.69,P=0.51)。可见NAb产生减弱了干扰素对Th1型细胞因子的促进作用和对Th2型细胞型细胞因子的抑制作用,NAb阳性患者BAFF表达水平相对性增高,但仍低于健康人水平。研究结论1、HBV感染者存在Th1/Th2型细胞因子表达比例失调,与Th1型细胞因子表达减弱及Th2型细胞因子表达增强均有关;干扰素治疗可以增强Th1型细胞因子γ-IFN的表达,从而改善机体的免疫紊乱,而干扰素中和抗体的产生减弱了干扰素的这种免疫调节作用;2、HBV感染者BAFF表达水平较低,特别是AsC患者显著低于健康人水平,因而BAFF与HBV感染者自身抗体的产生无关,但由于BAFF可增强机体免疫,促进Th1型细胞因子的表达,调整Th1/Th2型细胞因子表达比例失调,因而我们认为BAFF表达水平过低可能与HBV感染的慢性化有关;3、有研究表明IL-10及α-IFN可刺激BAFF表达,但在CHB患者体内IL-10表达水平较高,并给予大剂量α-IFN治疗的情况下,BAFF表达水平仍较低,所以我们认为HBV感染者可能存在BAFF生成障碍。第二部分CHB患者肝组织中细胞花结形成意义的研究研究背景:甲胎蛋白(AFP)是一种含糖蛋白,分子量约70kD,主要由肝细胞粗面内质网上的核糖体合成,在胎儿期内由卵黄囊和肝脏产生,出生后1周AFP迅速降至正常(＜10ng/ml),成人正常肝组织中没有AFP表达。当肝细胞或生殖腺胚胎组织发生恶性病变时,有关基因重新被激活一,原已丧失合成AFP能力的细胞重新开始合成AFP,导致血液中AFP含量明显升高。但在临床中,我们也常看到慢性肝炎患者AFP升高。目前多数学者认为病毒性肝炎患者AFP升高系肝细胞坏死后再生所致,病毒性肝炎患者受损伤的肝细胞再生,产生幼稚细胞,而幼稚细胞具有产生AFP的能力,使血清中AFP升高。血清AFP水平持续高于正常,并随炎症活动的增加明显升高,随着病程的延长,逐渐出现肝硬化倾向,AFP水平明显升高的患者提示其肝细胞本身存在着恶变倾向,随着病程的延长而最终发展成肝癌的机会增加。肝细胞花结(hepatic rosette):指在肝细胞大量坏死后,再生的肝细胞所形成的腺体样结构,常出现在重度坏死区附近,花结以挤压的肝窦和结缔组织包绕,肝细胞围绕毛细胆管,形成花结的肝细胞多被认为是较原始的肝细胞,能产生AFP。为观察肝细胞花结与AFP表达的相关性,我们用免疫组化的方法特异性的标记了肝组织中的AFP。研究目的:1、分析慢性病毒性肝炎不同临床类型中血清AFP的表达情况;2、探讨肝组织中细胞花结形成的意义。研究方法:1、检测378例病毒性肝炎患者包括140例慢性乙型肝炎(CHB)、140例肝硬化(CIR)、115例肝硬化失代偿及17例肝炎后肝癌(HCC)患者血清AFP水平,分析各组AFP的表达情况;2、对65例肝组织内有肝细胞花结形成和42例无肝细胞花结形成的病毒性肝炎患者及2例肝炎后肝癌患者用免疫组化的方法标记肝组织中的AFP,观察肝组织中AFP的表达情况;研究结果:1、AFP在乙型肝炎各临床类型中的表达情况:378例病毒性肝炎中有253例AFP异常,异常率66.9%,慢性乙型病毒性肝炎患者AFP阳性率显著低于肝硬化、肝硬化失代偿及肝炎后肝癌(HCC)患者(P＜0.05);AFP阳性率随病情进展逐渐升高,至肝硬化、肝硬化失代偿期已与肝炎后肝癌无显著性差异(P＞0.05)。AFP表达水平随病情进展也逐渐升高,病毒性肝炎各临床类型与HCC患者均有显著性差异(P=0.00)。2、肝细胞花结与血清AFP表达的相关性:肝细胞花结患者AFP阳性率明显高于无花结患者(χ~2=7.33,P=0.01),随花结量增多AFP阳性率有升高趋势;AFP表达水平亦高于无花结患者,随花结量增多AFP表达水平显著升高,大量花结组显著高于少量及中量花结患者(P＜0.05)。3、肝细胞花结与病情的相关性:花结量与病情进展有正相关性,随花结量增病重患者所占比例升高,大量花结组肝硬化患者显著高于少量花结组;病情相同情况下花结组与无花结组虽然AFP、ALT、总胆红素(TBIL)、白蛋白(ALB)均无统计学差异(P＞0.05),但可以看出:花结组AFP表达水平高于无花结组,两组AFP表达水平随病情进展均有上升趋势;ALT水平与病情进展无相关性。4、肝组织病理学检查结果:HE染色显示:肝细胞花结出现于肝细胞大量坏死区域,形成花结的肝细胞形态不同于正常肝细胞,体积较大,失去原有的排列结构,形成腺腔样结构,故称其为肝细胞花结。107例肝活检患者血清AFP水平在1.9ng/ml-1006ng/ml,免疫组化染色显示:花结患者和无花结患者肝组织内均未见明显AFP表达,即使肝组织内有大量肝细胞花结形成也未见明显AFP表达;肝癌标本中1例血清AFP水平在501.86 ng/ml时,肝组织内也未见明显AFP表达,另一例血清AFP水平69137.17 ng/ml,肝组织内可见大量AFP表达。研究结论:1、乙型肝炎各临床类型均存在AFP表达异常,血清AFP表达与病情进展相关,病情越重AFP阳性率及血清水平越高。2、肝细胞花结与血清AFP水平及病情进展均有正相关性,随肝细胞花结量的增多血清AFP表达水平升高、病重患者所占比例增加;肝硬化患者血清AFP水平升高可能既与肝细胞坏死再生有关,又与肝细胞基因表达改变有关。3、肝组织学检查表明血清AFP水平较低时(＜1000ng/ml)时,有肝细胞花结形成的肝组织中AFP表达不明显,肝组织中AFP的表达似仅与血清AFP水平有关。第三部分特发性炎性肌病患者肝脏损伤的研究研究背景:特发性炎性肌病(IIM)是一组病因未明的横纹肌非化脓性炎症,主要包括多发性肌炎(PM)、皮肌炎(DM),二者约占炎性肌病的70%,PM/DM的病因和发病机制尚不十分清楚,目前认为PM/DM可能是某具有特定遗传易感性的个体受环境因素的影响,触发机体免疫应答的改变,导致肌组织受损的一组病症。IIM可以影响骨骼肌、平滑肌、心肌、脑及心血管等多个系统,但对肝脏的影响目前尚不明确。CD8+T细胞介导的细胞免疫在PM致病机制起重要作用,AtsushiTakahashi等研究发现PM相关肝损伤与CD8+T细胞介导的细胞免疫有关;最近研究发现CD138+浆细胞介导的体液免疫在PM发病机制中同样起重要作用,但CD138+浆细胞与PM相关肝损伤是否也有关目前尚不清楚。Hideyuki Kojimal等认为“IIM相关性肝损伤和AIH的鉴别对于疾病的治疗和评估预后有重要意义,而国际上采用的自身免疫性肝炎评分系统对于区分IIM相关性肝损伤和AIH的有用性是不清楚”。故本研究对IIM患者及AIH患者行肝活检,HE染色观察肝组织损伤情况,并用免疫组化的方法标记肝组织中浸润的CD138+浆细胞,观察肝组织中CD138+浆细胞的浸润情况。研究目的:1、探讨转氨酶升高的特发性炎性肌病(IIM)患者血清ALT来源;2、观察IIM患者的肝组织损伤情况,探讨CD138+浆细胞在IIM相关肝损伤中的作用;3、分析IIM相关肝损伤与AIH肝损伤血清指标及组织学特点的差异研究方法:1、收集28例IIM患者和11例AIH患者肝功(ALT、AST)、心肌酶谱(CK、CK-MB、HBDH、LDH)、自身抗体(ANA、SMA)等临床资料,分析IIM患者血清ALT升高的原因,并比较IIM患者与AIH血清学指标的差异;2、对6例IIM患者和11例AIH患者行肝活检:常规HE染色,并用免疫疫组化的方法标记肝组织中浸润的CD138+浆细胞,观察肝组织的损伤情况及CD138+浆细胞的浸润情况。研究结果1血清学指标:IIM患者ALT均值198.8±209.0 U/L,50%(14/28)的患者ALT轻度升高,与健康人有显著性差异(P＜0.01),与AIH患者无统计学差异(P＞0.05);IIM患者乳酸脱氢酶(LDH)和羟丁酸脱氢酶(HBDH)异常率为100%和85.7%,高于肌酸激酶(CK)的异常率(78.6%);IIM和AIH患者ANA抗体阳性率分别为50%和54.5%,抗体总阳性率分别为61.1%和63.6%,自身抗体二者无显著性差异(P＞0.05);2肝组织病理学检查:IIM患者肝组织损伤轻微,无典型组织学特点,肝窦内和汇管区有少至中量炎症细胞浸润,免疫组化特异性染色未发现明显CD138+浆细胞浸润;AIH患者肝组织损伤较重,常伴有碎片状坏死、桥接坏死,汇管区有大量炎症细胞浸润并向周围肝实质扩散以及肝细胞玫瑰花环形成。,免疫组化特异性染色汇管区有明显CD138+浆细胞浸润,浸润的T淋巴细胞CD4+T细胞超过CD8+T细胞。研究结论1、转氨酶升高的IIM患者存在肝组织轻微损伤,血清ALT升高与肝组织肌肉组织等多种组织损伤有关;2、IIM患者肝组织中未见明显CD138+浆细胞浸润,CD138+浆细胞介导的体液免疫与IIM相关肝损伤的机制无关;3、根据血清转氨酶水平及自身抗体不能区分AIH肝损伤与IIM相关肝损伤;AIH肝损伤与IIM相关肝损伤肝组织学特点有显著不同,组织学检查是鉴别二者的金标准。