FLUTAX法显示纤毛虫微管胞器的改良及一种游仆虫细胞周期中微管胞器及其蛋白组分的研究

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本文在参考Arregui等报道的方法的基础上,对荧光紫杉醇染色(FLUTAX)显示纤毛虫细胞微管胞器的流程进行了改进,对其中一些试剂的配方作了调整,改进了多聚赖氨酸涂布玻片、皂苷孵育、多聚甲醛固定和TritonX-100渗透等步骤。按照改良的FLUTAX染色方法,以FLUTAX为探针跟踪标记了一种腹毛类纤毛虫游仆虫(Euplotessp.)的微管胞器和相关的结构微管的形态及其在生命周期不同时期的变化。无性生殖过程中,腹部纤毛器包括口围带、波动膜、额腹横棘毛和尾棘毛发生瓦解,新纤毛器在细胞皮层的特定位置发生,从相应纤毛器原基的发生、组排和迁移,至最终形成前、后两套新的纤毛器,新结构的形成和老结构的瓦解是一个相伴随的过程。背面纤毛器的发生中,新纤毛原基在老纤毛基体后发生,最终形成前、后两套新背纤毛。根据游仆虫在无性生殖过程中微管胞器的分化特征,推测,微管胞器在纤毛虫生命活动不同时期发生了连续的变化,是细胞生命活动中的至关重要的结构;在形态发生和结构分化的过程中,先存微管结构对新结构的形成可能有物质贡献,并且具有结构诱导和模式定位的作用。 应用α微管蛋白抗体和γ微管蛋白抗体标记不同时期游仆虫微管胞器的发生过程。α微管蛋白抗体具有较强的特异性,与游仆虫胞器及骨架中的α微管蛋白特异性结合,跟踪标记了游仆虫在细胞间期和分裂期的纤毛器骨架及胞器微管的发生、迁移、定位。间期细胞除其基体胞器被标记,在游仆虫背部可见明显的皮层网格和背触毛外,还发现细胞腹部和背部均被较细的纵向纤维包裹,构成较复杂的纤维网络。细胞分裂期,游仆虫腹部棘毛从产生原基到新纤毛器成熟直至迁移定位,这一系列过程似乎都与老纤毛器及其基体有着密切联系;背触毛的发生可能是在老背触毛基体的指导下完成的,老背触毛可能起了模板作用。γ微管蛋白抗体应特异地与γ微管蛋白结合,但实验结果显示,该抗体特异性不高,标记不明显,推测与γ微管蛋白抗体本身特异性不强有关。本实验应用的抗体为鼠源抗体,可能是种属差异太大,导致特异性不高。 此外,利用三种微管蛋白抗体分析游仆虫微管蛋白的主要成分:α微管蛋白、β微管蛋白和γ微管蛋白。本实验中用到的一抗包括:鼠抗α微管蛋白抗体(Sigma),鼠抗β微管蛋白抗体(Sigma),鼠抗γ微管蛋白抗体(Sigma)和兔抗γ微管蛋白抗体(Abcam)。实验结果显示:α、β微管蛋白分子量均为55KD左右,在游仆虫体内表达稳定,且与抗体结合特异性较好;两种γ微管蛋白抗体对游仆虫体内的γ微管蛋白标记都不是很清晰,其中,SIGAMA抗体标记较弱,几乎看不到明显的目的条带,而ABCAM的抗体非特异性条带太多,也无分析价值。Westernblotting结果进一步验证了前面的假设,即由于抗体本身存在特异性差异,免疫荧光实验中,α微管蛋白实验效果较好,γ微管蛋白抗体效果却不尽人意。
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