乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,发病率居全世界女性恶性肿瘤的首位。乳腺癌目前的主要治疗手段是手术切除结合放化疗。但是仍然有部分肿瘤患者会出现肿瘤的复发和转移。乳腺癌的复发和转移是致乳腺癌死亡的最重要的原因。乳腺癌死亡的患者中,约90%的人死于肿瘤转移。肿瘤转移实际是多步骤多基因参与的过程。在肿瘤转移的过程中,肿瘤细胞往往发生上皮间质转化(EMT)。对肿瘤转移分子机制的研究有利于研发更有效的治疗手段。近年来,研究认为肿瘤干细胞在肿瘤复发和转移过程中起着重要的作用。肿瘤干细胞是肿瘤中一小部分具有干细胞特性的细胞,不仅能够自我更新也能够分化产生不同的子代,对比起肿瘤中非干细胞,具有强大的成瘤性。多种肿瘤中存在肿瘤干细胞,如肺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、肺癌等。乳腺癌干细胞是最早发现的实体瘤干细胞之一。CD44、CD24、乙醛脱氢酶1(Aldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)是乳腺癌干细胞最常用的标记分子。研究发现在乳腺癌中几百个Lin-CD44+CD24-/low的细胞即可在NOD/SCID小鼠中形成种植瘤,而上千个非Lin-CD44+CD24-/low细胞不能成瘤,提示了肿瘤干细胞的成瘤能力。ALDH1是新晋的乳腺癌干细胞标记分子,乳腺癌干细胞中ALDH1的活性增高,ALDH1+的细胞具有自我更新及很强成瘤能力。八聚体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor 4,OCT-4)在肿瘤干细胞中常存在高表达,认为是肿瘤干细胞的标记分子之一。目前认为,乳腺癌干细胞参与乳腺癌的发生发展,在乳腺癌的转移、复发、化疗耐药及放疗失败中均起作用。受体型酪氨酸磷酸酶D(Receptor-type tyrosine-protein phosphataseδ,PTPRD)属于受体型酪氨酸磷酸酶家族(Receptor-type tyrosine-protein phosphatase,PTPRs),该家族有21个成员,根据细胞外结构域将其分为8个亚家族。PTPRD属于LAR(leukocyte common antigen-related)样PTPR家族,该亚家族有PTPRD、PTPRS及LAR,在结构上具有高度的同源性。PTPRD作为受体型磷酸酶,具有胞外区、跨膜区和胞内区。全长的PTPRD胞外区包含三个免疫球蛋白样结构域和八个FN-III样结构域,通过跨膜肽连接到一个细胞内区,细胞内区具有两个酪氨酸磷酸酶结构域近膜D1及远膜D2,其中,D1区具有磷酸酶活性;D2区没有磷酸酶活性,可能与保持蛋白稳定性及调节蛋白二聚化有关。PTPRD的胞外区结构类似细胞间粘附分子,在细胞上可以和相邻PTPRD分子形成同二聚体介导细胞骨架重构和细胞的迁移,与神经细胞轴突的形成及导向有关。PTPRD基因位于染色体9p,最近在多种人类肿瘤中发现了PTPRD的基因缺失、基因突变或表观遗传学沉默,例如头颈部鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤、肺癌、神经母细胞瘤、肝癌、食管癌等。在这些肿瘤中存在着PTPRD的低表达或失活。所以认为PTPRD可能是抑癌基因。PTPRD可能通过其细胞粘附分子的作用调节肿瘤的转移,也可能通过其磷酸酶活性调节肿瘤的转移。PTPR作为酪氨酸磷酸酶,可以同酪氨酸蛋白激酶共同调节酪氨酸磷酸化,参与细胞信号转导途径的调节。研究发现PTPRD可以使磷酸化的信号转导子及转录激活子3(signal transducer and activator of transcription-3,STAT3)去磷酸化而失活。STAT3是癌基因,作为信号转导子及转录激活因子,可以促进肿瘤的发生、促进转移、促进增殖、抑制凋亡。本实验主要研究PTPRD对乳腺癌侵袭和转移的作用,对乳腺癌干细胞的干细胞特性的影响,并研究PTPRD与白介素6(IL-6)STAT3信号转导通路的关系。第一部分PTPRD下调对乳腺癌细胞增生、凋亡、迁移和侵袭的影响目的:探讨PTPRD下调对乳腺癌细胞增生、凋亡、细胞周期及迁移和侵袭能力的影响,PTPRD下调对上皮间质转化相关分子E粘连蛋白(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)的表达的影响。研究PTPRD在乳腺癌细胞系中的生物学作用。方法:采用小RNA干扰的方法下调PTPRD的表达,化学合成PTPRD si RNA及对照无关序列(NC)转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231,通过划痕实验、Transwell小室模型检测PTPRD下调对乳腺癌细胞侵袭和迁移的影响。Western Blot(WB)法检测EMT相关蛋白E-cadherin及Vimentin的表达。流式细胞技术检测化疗药物紫杉醇作用下,PTPRD si RNA对乳腺癌细胞凋亡的影响。CCK8实验检测PTPRD si RNA对细胞增生的影响。流式细胞技术检测PTPRD si RNA对细胞周期的影响。结果:划痕实验及Transwell小室模型均发现转染了PTPRD si RNA的细胞迁移和侵袭能力显著高于无关序列NC组。细胞转染PTPRD si RNA后,其Vimentin表达上调,E-cadherin蛋白表达显著下调(P<0.05)。化疗药物紫杉醇作用下,PTPRD si RNA组凋亡水平显著低于NC组。PTPRD si RNA转染的细胞在细胞周期及细胞增生水平与NC没有差异。结论:PTPRD下调可以促进乳腺癌细胞系MDA-MB-231的迁移和侵袭,促进EMT。PTPRD下调对细胞凋亡具有抑制作用,但对细胞的增生和细胞周期没有显著影响。第二部分PTPRD与乳腺癌干细胞之间的关系及小鼠成瘤实验目的:研究PTPRD下调对乳腺癌干细胞特性的影响。研究PTPRD及相关分子STAT3、P-STAT3,EMT相关分子E-cadherin及Vimentin在乳腺癌干细胞的表达。研究PTPRD下调对乳腺癌细胞在裸鼠中成瘤能力的影响。方法:通过免疫磁珠法从乳腺癌细胞系MDA-MB-231中分选出乳腺癌干细胞(CD44+/CD24-)及乳腺癌非干细胞(本文中以后简称非干细胞)。q RT-PCR及WB法检测PTPRD及STAT3在乳腺癌干细胞及非干细胞中m RNA及蛋白的表达,WB法检测P-STAT3、E-cadherin、Vimentin、ALDH1及OCT-4在癌干细胞及非干细胞中的表达。通过PTPRD si RNA下调乳腺癌细胞中PTPRD表达水平,无血清培养基悬浮培养干细胞球检测PTPRD下调对乳腺癌干细胞球形成能力的影响;克隆形成实验检测PTPRD下调对细胞克隆形成能力及全克隆形成能力的影响;流式细胞技术检测PTPRD下调对乳腺癌细胞中CD44+/CD24-细胞比例的影响;WB检测PTPRD下调对乳腺癌干细胞标记分子ALDH1及OCT-4的表达的影响。PTPRD Sh RNA质粒转染乳腺癌细胞,1×106个细胞接种于裸鼠乳腺垫,检测PTPRD下调对乳腺癌细胞成瘤能力的影响。结果:PTPRD下调促进乳腺球的形成,乳腺球的数量及大小显著高于NC组(P<0.05)。PTPRD下调促进乳腺癌细胞克隆形成能力,形成的克隆数及克隆的平均直径显著大于NC组(P<0.05),且全克隆的比例显著高于NC组(P<0.05)。转染有PTPRD si RNA的细胞中CD44+/CD24-比例显著上调。PTPRD sh RNA转染的乳腺癌细胞在小鼠中的成瘤能力强于NC组,所形成的肿瘤直径显著高于NC组(P<0.05)。PTPRD si RNA转染的细胞中癌干细胞标记分子ALDH1及OCT-4的表达显著高于NC组(P<0.05)。通过免疫磁珠法成功分选出CD44+/CD24-的细胞群,癌干细胞标记分子ALDH1及OCT-4在CD44+/CD24-细胞群中的表达水平显著高于非干细胞组,说明成功分选出了乳腺癌干细胞。WB及免疫荧光法发现PTPRD在乳腺癌干细胞中的表达显著低于非干细胞,STAT3及P-STAT3在癌干细胞及非干细胞中的中的表达没有显著差异。EMT相关分子E-cadherin在癌干细胞中的表达显著低于非干细胞,而Vimentin在癌干细胞中的表达显著高于非干细胞(P<0.05)。q RT-PCR发现PTPRD m RNA在癌干细胞中的表达显著低于非干细胞(P<0.05),而STAT3 m RNA在二者之间的表达没有显著差异。结论:PTPRD下调可以增强乳腺癌干细胞特性,乳腺癌干细胞中PTPRD低表达,提示PTPRD在乳腺癌的干细胞特性如自我更新及成瘤中起作用。CD44+/CD24-细胞群中E-cadherin下调,Vimentin上调说明乳腺癌干细胞具有间叶细胞表型。第三部分PTPRD作用的分子机制的探讨目的:研究IL-6信号转导通路在乳腺癌细胞迁移和侵袭中的作用。研究PTPRD下调对STAT3活化的影响。研究IL-6作用于细胞的过程中,PTPRD水平变化及其与STAT3活化的关系,并检测此过程中EMT相关蛋白及干细胞标记分子的表达。方法:PTPRD si RNA转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231,WB法检测PTPRD、STAT3及P-STAT3表达水平。IL-6作用于乳腺癌细胞系,分别于1小时(h)、3h、6h、12h、24h、48h检测PTPRD、STAT3、P-STAT3、E-cadherin、Vimentin、ALDH1及OCT-4的表达。划痕实验及Transwell小室模型检测IL-6对细胞迁移的影响,CCK8实验检测IL-6对细胞增生能力的影响。结果:IL-6促进乳腺细胞的迁移和侵袭。IL-6作用过程中,STAT3从1h即有活化,活化水平逐渐增高,PTPRD表达在6-24h显著上调,48h恢复正常水平甚至略有下调。在此过程中,EMT相关分子E-cadherin表达下调,Vimentin表达上调;干细胞标记分子ALDH1及OCT-4表达上调。PTPRD在PTPRD si RNA转染细胞中的水平显著低于NC组,STAT3的表达在PTPRD si RNA组及NC组没有差异,而P-STAT3在PTPRD si RNA组中表达显著上调。结论:PTPRD可以使P-STAT3去磷酸化而失活;IL-6激活STAT3的过程中,可以促进PTPRD的表达。这提示PTPRD是IL-6 STAT3通路的抑制因子。当IL-6激活STAT3后,PTPRD水平同时上调,从而使活化的STAT3迅速去磷酸化而失活,预防该通路的过度活化,保持细胞稳态。IL-6可以促进EMT,并促进干细胞标记分子的表达。第四部分PTPRD、P-STAT3在乳腺癌组织中的表达与临床病理特点和预后的关系目的:对比研究PTPRD及P-STAT3在乳腺癌及正常乳腺中的表达水平;研究PTPRD及P-STAT3的表达与乳腺癌大小、TNM分期、分级等临床病理特点的关系;研究PTPRD、P-STAT3在乳腺癌中的表达与患者预后的关系。方法:收集乳腺癌肿瘤76例,正常乳腺10例,免疫组织化学方法检测PTPRD、P-STAT3在乳腺癌组织及乳腺组织中的表达。收集临床病理资料,并进行随访调查预后。SPSS19.0统计软件统计PTPRD、P-STAT3在乳腺癌中的表达,统计PTPRD、P-STAT3在乳腺癌中表达与肿瘤患者年龄、肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤分级、肿瘤的分子分型、乳腺癌中HER2、ER、PR及PCNA表达的关系。Kaplan-Meier法分析PTPRD、P-STAT3在乳腺癌中的表达与预后的关系。结果:PTPRD在乳腺癌中的表达与正常乳腺中的表达没有显著差异。P-STAT3在乳腺癌中的表达显著强于乳腺组织。PTPRD的表达与肿瘤大小及ER的表达显著相关(P<0.05)。PTPRD表达低的肿瘤直径更大,ER表达低的肿瘤中PTPRD的表达相对也低。P-STAT3在肿瘤中的表达与肿瘤的分级有关(P<0.05)。P-STAT3在级别低的肿瘤中表达相对高。PTPRD与P-STAT3在乳腺癌中的表达呈正相关。PTPRD在乳腺癌中的表达与预后不具显著相关性。P-STAT3表达低的患者预后不良(P<0.05)。结论:PTPRD在乳腺癌中主要与乳腺癌直径大小有关,PTPRD表达低的乳腺癌直径大,可能在乳腺癌中发挥抑癌基因的作用。P-STAT3在乳腺癌中与肿瘤分化密切相关,P-STAT3表达高的乳腺癌预后相对好。