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研究目的构建pET-32a（+）-GP73原核表达载体，在大肠杆菌中表达并纯化重组GP73；构建单链DNA（ssDNA）文库，以重组GP73为靶标，采用SELEX技术筛选与GP73亲和力强的适配子，并对所筛选的适配子进行结合率的检测，初步运用于临床正常胆管和肝癌组织标本的免疫组化分析，为进一步建立基于适配子的肝癌新标志物GP73的免疫检测方法奠定基础。方法一、pET-32a（+）-GP73原核表达载体的构建及GP73的表达和纯化（1）以GP73基因开放读码框为靶序列，设计相应引物，PCR扩增GP73基因。（2）将GP73基因与pMD-19T载体相连，转化入质粒保存菌DH5α中，筛选出与pMD-19T连接成功的单克隆菌株。（3）经测序正确后提取pMD-19T/GP73重组质粒，双酶切处理所提取的质粒，行琼脂糖电泳回收GP73基因片段，构建pET-32a（+）-GP73原核表达载体，转化原核表达菌种BL21（4）调整IPTG终浓度分别为0.2mmol/L、0.6mmol/L、1.0mmol/L，诱导表达时间分别为2h、4h、6h，经SDS-PAGE分析后，选择最适诱导浓度和表达时间作为实验条件，用Ni-NTA亲和柱纯化表达蛋白，Western-blot对GP73进行鉴定，并利用GP73检测试剂盒测定纯化蛋白的浓度。二、随机文库的构建以及GP73适配子的筛选（1）设计合成全长为85bp的单链DNA（ssDNA）文库，两端分别为序列固定的20个碱基，以便设计相应的PCR引物，中间45个碱基为随机序列，整个文库容量达到了454；（2）以重组人GP73为靶分子，将纯化的GP73包被于96孔板上，同时设立BSA空白对照孔，经反筛将未与空白对照孔结合的ssDNA放入包被有GP73的板孔中孵育，洗涤后仅有极少数序列与靶蛋白结合，洗脱出与GP73结合的ssDNA，用5端标记有生物素的下游引物和正常的上游引物进行PCR，将ssDNA扩增为dsDNA，此时非文库链的5端即可标记上生物素；（3）将上述步骤所得的PCR产物与链霉亲和素磁珠混合，PCR产物通过生物素与磁珠上的亲和素结合，此时加入适量的碱性溶液，使dsDNA解链成ssDNA，5端标记有生物素的非文库链仍然与磁珠相连，而文库链游离在溶液中，利用磁力架吸引磁珠分离出文库链，获得次一级ssDNA候选库。（4）将次一级ssDNA候选库再与GP73温育，进入第二轮筛选。如此循环，随着筛选轮数的不断增加，低亲和力序列逐渐被淘汰。经过大约6-12轮筛选后，与GP73结合力强的适配子得到富集，结合率达到饱和，停止筛选。三、运用碱性磷酸酶标记的地高辛抗体系统检测不同筛选轮数所得文库与GP73的结合率（1）保留1、3、5、6、8、10轮筛选文库，用5端地高辛修饰的上游引物和5端生物素修饰的下游引物对上述文库分别进行PCR扩增，获得的PCR产物，非文库链5端为生物素修饰，文库链为地高辛修饰，然后利用磁珠磁力架系统，分离出地高辛标记的文库链（2）分离出的文库链分别与GP73进行孵育，洗涤后加入碱性磷酸酶标记的地高辛抗体进行反应，以PNPP显色，终止反应后用酶标仪测定405nm OD值。（3）根据测得的OD值做图分析，选择结合率较高并趋于较稳定的筛选文库的进行克隆、测序。（4）分析测序所得ssDNA的二级结构，找到与GP73结合较理想的ssDNA作为GP73适配子，并根据非竞争性ELISA法摸索筛选的适配子与重组GP73的亲和常数。四、阻断实验和免疫组化实验对GP73适配子结合特异性的鉴定（1）将GP73多克隆抗体稀释成不同浓度，分别与包被有相同浓度GP73的板孔孵育，洗涤后依次向各孔中加入固定浓度的适配子，观察在不同浓度的多克隆抗体阻断下适配子与GP73结合率的变化。（2）将筛选所得的适配子用生物素标记后运用于临床正常胆管和肝癌组织的免疫组化分析，观察其是否能与组织中的GP73蛋白相结合。研究结果（1）成功扩增出GP73基因1200bp，与理论值相符，将其与pMD-19T相连，测序无突变（2）双酶切回收GP73基因片段，成功构建了pET-32a-GP73原核表达载体。（3）经IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析显示，在诱导菌夜上清中出现蛋白分子量约为68Kd目的蛋白，与预期值相符。（4）SDS-PAGE分析显示，经Ni-NTA亲和柱纯化后，绝大部分杂蛋白被去除，重组GP73蛋白得到了很好的纯化，Western blot检测证明重组GP73能够很好的与GP73多克隆抗体结合，GP73检测试剂盒分析得到纯化蛋白浓度为2μg/ml。（5）经过10轮的筛选，运用碱性磷酸酶标记的地高辛抗体系统检测1、3、5、6、8、10轮筛选文库与GP73结合率，随着筛选轮数的不断增加，适配子文库与GP73的结合率从0.057增加到0.612，不断增加，到6、8、10轮的结合率分别为0.528、0.579、0.612，增加幅度不明显，表示结合率趋于饱和。（6）选择6、8、10轮筛选文库进行克隆测序、家族分析，在6轮出现一组相同序列，即aptamer6-25和aptamer6-35，序列为：ACGCTCGGATGCCACTACAG*********************************************CTCATGGACGTGCTGGTGAC（正在申请专利，故用星号代表筛选所得的随机序列），在第10轮中也出现了一组相同的序列，即aptamer10-2和aptamer10-3,序列为：ACGCTCGGATGCCACTACAG*********************************************CTCATGGACGTGCTGGTGAC（正在申请专利，故用星号代表筛选所得的随机序列）。（7）利用非竞争ELISA法探索性测定aptamer10-2功能性亲和常数范围为：（3.96±1.86）×103M-1。（8）在GP73多克隆抗体浓度为1:500到1:1000之间时，适配子和GP73的结合率分别为0.057和0.083，处于较低水平，超出这个范围，适配子和GP73的结合率从0.083上升至0.52，这从侧面说明了筛选所得的适配子能和目的蛋白特异性的结合。结论本实验扩增了人GP73基因，并构建了pET-32a（+）-GP73原核表达载体，成功诱导表达并纯化了重组人GP73蛋白；本研究通过随机单链DNA文库的建立，对所纯化GP73进行适配子的筛选，在筛选过程中，文库和GP73的结合率从0.057增加到0.612，不断增加，到6、8、10轮的结合率分别为0.528、0.579、0.612，增加幅度不明显，表示结合率趋于饱和，所以选择这三轮筛选所得的文库进行克隆测序，分别在第6和第10轮的筛选中，获得了两组序列相同的ssDNA，选择第10轮筛选所得的适配子，进行探索性亲和常数范围的测定，获得亲和常数范围为（3.96±1.86）×103M-1，，解离常数的平均值为：250nmol/L,获得了较低解离常数的适配子，证明所筛选适配子的实用性；阻断实验分析得到随着GP73多克隆抗体稀释倍数的增加，适配子同GP73的结合率也随之增加，间接证明了筛选所得的适配子能和目的蛋白特异性的结合，同时免疫组化实验显示aptamer10-2能够识别正常胆管组织和肝癌组织中表达的GP73蛋白，为进一步建立基于适配子的肝癌新标志物GP73的免疫检测方法奠定基础。