目的:视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是指一种以视网膜感光细胞(包括:视锥细胞、视杆细胞)进行性凋亡为病理基础的遗传性眼部疾病,它常以夜盲为首发症状,随着病情的发展可以出现进展性的视野狭窄,视力下降,甚至视力丧失,在中国视网膜色素变性的发病率达到1/1000,目前在临床上尚无有效的治疗方法。随着干细胞研究的不断发展,作为再生医疗的前沿技术,干细胞疗法有可能成为治疗RP的潜在方法。干细胞有多种的组织来源,如:胚胎干细胞、间充质干细胞、神经干细胞等。虽然胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)具有全能性,但其具有的致瘤性、排斥反应、伦理问题等风险阻碍了ESCs进一步的临床拓展和应用。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)虽然更容易获得,具有免疫调节功能,又能分泌大量神经营养物质,但作为非神经类干细胞,其治疗效果有一定的局限性。人视网膜祖细胞(human retinal progenitor cells,hRPCs)是一类成体神经类干细胞,具有自我更新和定向分化的潜能,同时hRPCs具有分泌支持视网膜神经细胞存活和发育的神经营养因子的能力,并且由于hRPCs的分化能力只向视网膜细胞方向分化的特性,理论上具有较低的致瘤性,较为安全。因此hRPCs是一种具有抗凋亡潜能的成体神经干细胞,被认为可能是治疗RP的重要种子细胞。但以往研究采用hRPCs视网膜下注射的方法,在临床使用过程中操作难度大,有排斥反应,并且具有一定操作风险,可以引起白内障、玻璃体腔出血、视网膜脱离等严重的眼部并发症,而眼睛的玻璃体腔是人体的相对免疫赦免区,操作相对简单且安全,临床应用广泛、成熟,所以hRPCs玻璃体腔注射移植可能是hRPCs做眼部移植更好的手术方式。本研究探索了hRPCs体外分离、培养、扩增和鉴定,并检测了它的致瘤性,然后采用hRPCs玻璃体腔注射移植治疗视网膜变性的RCS(Royal College of Surgeons)大鼠模型,从而探讨hRPCs安全性以及玻璃体腔注射对视网膜变性的治疗作用和潜在功能。研究方法:1、视网膜组织分离,人视网膜祖细胞(human retinal progenitor cells,hRPCs)的体外培养,并扩增hRPCs,传代至第6代;2、采用流式细胞仪检测hRPCs表面标志物的表达;3、采用免疫荧光染色检测血清诱导分化后的hRPCs的表面抗原;4、检测hRPCs的内毒素、支原体、需氧菌、厌氧菌等安全性指标;5、对hRPCs进行核型检测;6、通过裸鼠致瘤性实验,进行大体观察,病理组织切片等来检测本研究培养的hRPCs是否存在致瘤性;7、将hRPCs进行RCS大鼠模型的玻璃体腔内注射移植,并检测视网膜电图(electroretinogram,ERG)、光学相干断层扫描(optical coherence tomography,OCT)、裂隙灯等指标检测视网膜功能的变化及玻璃体腔注射的安全性;8、通过对不同处理组的RCS大鼠模型进行病理切片,并对病理切片中的视网膜外核层细胞进行计数以检测保留的视网膜感光细胞数量,验证hRPCs对变性视网膜功能是否有保护作用;9、采用Quantibody(R)Human Cytokine Antibody Array 9000芯片对hRPCs的细胞因子表达进行分析检测;10、对RCS大鼠模型进行玻璃体腔重复注射hRPCs,检测ERG和病理切片观察其对变性视网膜的保护作用时间。结果:hRPCs经分离体外培养至第6代,经流式细胞仪检测鉴定,结果显示hRPCs表达神经干细胞标志物Nestin达到99.9%,代表细胞干性增殖能力的标志物Ki67达到69.6%,代表神经视网膜发育相关的特征性标志物Pax6达到73.55%,另一特征性标记物Chx10达到88.8%。hRPCs培养基样品内毒素结果显示:0.4137EU/ml<0.5 EU/ml,指标合格。hRPCs培养基样品的微生物检测中支原体、需氧菌、厌氧菌检测均为阴性。在经过10%胎牛血清诱导后,hRPCs高表达标记物Map2(microtubule-associated protein 2),NF(neurofilament),rhodopsin,recoverin,GFAP(glial fibrillary acidic protein),证明培养的hRPCs具有分化功能。进一步检测hRPC的成瘤性,把不同代次的hRPCs注射到BALB/c裸鼠中,移植16周后检查畸胎瘤的形成,hRPCs注射组及阴性对照均没有畸胎瘤形成,而作为对照的肿瘤细胞注射组则全部有明显的肿瘤形成。组织病理切片的HE染色后,第6代和第12代的hRPCs注射组及阴性对照中的肝、脾脏、肺、肾组织大体切片HE染色均未发现异常改变,然而在肿瘤注射的阳性对照组,在上述的器官中则发现了肿瘤组织的形成。对RCS大鼠进行hRPCs玻璃体腔注射移植后,通过ERG检测发现与感光细胞相关的b波振幅均值在第4周(P=0.0418<0.05)、及第8周(P=0.0386<0.05)均显著高于HBSS注射组和未治疗组。然而在第12周hRPCs治疗组与HBSS组及未治疗组没有显著性差异。对所有RCS大鼠不同时间点进行OCT及裂隙灯检查,未发现明显异常。在注射后的第8周进一步对RCS大鼠处死,进行病理切片HE染色检查,发现hRPCs治疗组的视网膜外核层厚度显著高于HBSS注射组及未治疗组。我们对注射后第2、4、8、12周的RCS大鼠视网膜外核层细胞进行了细胞计数统计,发现在第2、4、8周,hRPCs注射组的视网膜外核层细胞保留的数量都显著高于HBSS组及未治疗组(P=0.0106<0.05,P=0.0479<0.05,P=0.0446<0.05)。而且,我们发现视网膜外核层细胞数与ERG b波振幅具有相关性。通过Quantibody Human Cytokine Antibody Array 9000芯片对hRPCs上清液中神经营养因子的表达进行检测,发现GDF-15,PDGF-AA,EGF,和NT-4有显著的高表达。在重复玻璃体腔注射的实验中的ERG b波振幅及病理切片均发现玻璃体腔注射hRPCs及视网膜下注射hRPCs均可保护视网膜,但视网膜下注射比单次注射维持时间更长,而重复注射hRPCs可以延长hRPCs的保护作用,达到视网膜下注射hRPCs的水平。结论:本研究发现hRPCs体外培养后指标安全、没有致瘤性,进行玻璃体腔注射移植可以有效的保护RCS大鼠的视网膜感光细胞,而且hRPCs可以释放多种神经营养因子,可能是其发挥保护作用的潜在机制。hRPCs单次玻璃体腔注射的保护作用没有视网膜下单次注射维持的时间长,但hRPCs重复注射可以延长保护的时间,达到与视网膜下注射相似的水平。