【摘 要】
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扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)技术是Zabeau和Vos等1993年发明的一项分子标记技术,其检测原理是基于对基因组进行限制性酶切和选择性扩
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扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)技术是Zabeau和Vos等1993年发明的一项分子标记技术,其检测原理是基于对基因组进行限制性酶切和选择性扩增所产生的DNA片段多态性。AFLP技术结合了RFLP技术的稳定可靠性和PCR技术的简便高效性,多态性检出率高,非常适于遗传多样性分析、遗传作图、亲缘鉴定和分子标记研究。荷斯坦是我国奶牛的主要品种,随着我国奶业飞速发展,奶牛群体改良成为当前奶牛育种面临的迫切任务,基于AFLP技术的分子标记技术可以为此提供新的辅助育种技术。由于AFLP技术比较复杂,对实验操作的要求较高,国内迄今未有荷斯坦牛AFLP检测方法的报道(国外实验室在AFLP检测中主要采用同位素标记或荧光素标记方法,同位素标记方法成本高安全性差,荧光素标记成本高并需要配备特殊的检测设备如Sequence仪。AFLP银染技术由于其成本低无污染,不需特殊的检测设备,非常有利于AFLP技术的推广应用,但银染检测结果稳定性较差,需对银染AFLP技术进行优化才能得到比较满意的结果)。本研究首先在参考相关文献的基础上,对中国荷斯坦奶牛基因组AFLP指纹图谱构建的各项条件进行了优化,经反复摸索,建立了稳定的低成本的银染AFLP分析体系。其次选择两组限制性酶组合共100对选择性扩增引物进行扩增效果和多态性分析,寻找适宜荷斯坦奶牛的AFLP引物。最后通过对60头荷斯坦母牛(来自1200多头有完整DHI记录的荷斯坦群体,其中10头极端高产奶量vs10头极端低产奶量,10头极端高乳脂率和乳蛋白率vs 10头极端低乳脂率和乳蛋白率,10头极端高体细胞评分vs10头极端高体细胞评分)进行了AFLP检测,探讨AFLP应用于中国荷斯坦牛重要经济性状标记育种的可行性,取得的主要结果如下:1.建立了稳定、高效的中国荷斯坦牛分子标记AFLP分析体系:制备高质量的基因组DNA,及对AFLP涉及到的DNA提取、酶切、接头连接、预扩增、选择性扩增等各个步骤进行了探讨,确立了最适反应条件。2.在建立AFLP的银染技术体系,发现温度对整个过程有较大影响,特别是银染液和显色液,并确定最适温度范围,取得了良好的染色效果。银染
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