目的：　　放射治疗是脑、头颈部良、恶性肿瘤等的重要治疗手段，随着放疗技术的提高，这类肿瘤患者的预后明显改善。然而越来越多研究表明放疗可引起患者出现进行性加重的认知障碍，因此放射性脑损伤防护日益受到重视，目前已成为放射生物学领域的研究热点。米诺环素是一种临床常用的四环素类抗生素，可通过血脑屏障，具有广谱抗菌、给药方便、药效持久、价格低廉等优点。研究表明其在AD、PD等神经系统疾病模型中可发挥重要的神经保护作用。本课题组前期体内实验研究证实米诺环素可改善大鼠全脑照射导致的认知障碍，抑制照射诱导的新生神经元凋亡。故本研究主要从体外水平探讨米诺环素抑制受照射海马神经元凋亡的分子调节机制。首先在体外确证米诺环素对受照原代培养的神经元的保护作用，然后以HT22神经元细胞系为对象，从不同方面探究米诺环素抑制电离辐射诱导HT22细胞凋亡的保护途径，继而将该保护途径中关键因子干扰后检测米诺环素的保护作用，以探讨米诺环素保护受照HT22的具体分子机制，从而确证米诺环素在脑部、头颈部肿瘤放疗患者中的潜在应用价值。　　实验方法：　　本课题首先以自噬阳性细胞百分比和细胞凋亡率为指标验证米诺环素对受照的原代神经元的保护作用。　　而后本研究采用永生化的小鼠海马神经元细胞HT22深入研究米诺环素保护作用的分子机制。首先通过结晶紫实验观察不同药物浓度下HT22细胞的增殖情况，确定米诺环素的最适工作浓度，然后通过克隆形成实验检测不同照射剂量下细胞的存活水平确证米诺环素的保护效应，并且通过免疫荧光和Western Blot检测53BP1 foci和相关DNA损伤应激蛋白来评估米诺环素对X射线照射后细胞DNA双链断裂修复情况的影响，再通过流式检测受照HT22细胞周期分布的情况来探索米诺环素对其细胞周期的影响。　　然后再以细胞凋亡率及自噬阳性细胞百分比为观察指标，用流式细胞术探究不同处理条件下电离辐射对细胞的影响以及米诺环素的保护作用。用自噬抑制剂3-MA预处理HT22细胞抑制其内自噬通路的激活，观察X射线诱导的细胞凋亡率的变化以及米诺环素的作用，用AMPK激活剂A769662激活AMPKα1通路，观察射线诱导的细胞凋亡水平及自噬水平的变化。首先用流式细胞术、免疫荧光等实验检测不同条件下不同时间点射线诱导的细胞自噬水平的变化，流式细胞术检测不同条件下细胞凋亡水平的变化；接着采用PCR检测HT22细胞体内AMPKα1及AMPKα2表达水平，Western Blot检测不同条件下HT22细胞受照后AMPKα1—自噬—凋亡信号通路的激活情况，观察米诺环素是否促进X射线诱导的LC3 II、Caspase3的激活以及AMPKα1的磷酸化；加入A769662激活AMPKα1或通过慢病毒干扰细胞体内的AMPKα1基因的表达，观察蛋白LC3 II、cleaved caspase3的表达变化以及米诺环素的作用。　　最后以ROS为指标，检测X射线诱导的HT22细胞ROS水平的变化情况以及加入米诺环素后的变化情况。同时采用catalase和NAC两种抗氧化剂观察其对射线诱导产生的ROS的影响，再观察加入catalase和NAC后射线诱导的细胞凋亡水平及自噬水平的变化，然后再使用Western Blot技术检测相应蛋白表达情况以验证上述结果。　　结果：　　1、首先将原代培养的成熟神经元作为本研究的对象，发现30Gy X射线作用于成熟神经元后24、48 h即可诱导其凋亡水平分别提高至对照组的3.92和2.89倍，而米诺环素明显抑制了X射线诱导的细胞凋亡，与单纯照射组相比，可分别降低55%和45%。照后24、48 h，成熟神经元体内自噬通路即可被X射线激活，自噬阳性细胞百分比分别为5.21、5.76%，而X射线联合米诺环素处理组自噬阳性细胞百分比进一步提高，约6.5、8.27%。由此提示，米诺环素促进激活受照原代培养的神经元的自噬通路抑制射线诱导的神经元的凋亡。　　2、接着，本研究继续以小鼠海马神经元细胞HT22为对象，深入探讨米诺环素的具体保护机制。首先通过结晶紫实验发现不同浓度米诺环素预处理HT22细胞，其工作浓度仅在4μM以下时对HT22细胞的增殖没有明显的抑制作用。因此，将米诺环素最终的工作浓度定为4μM。接着检测不同X射线照射下HT22细胞的克隆存活能力以及米诺环素预处理后的变化，发现射线后呈剂量依赖性地抑制HT22细胞的克隆形成率；加入米诺环素组与单纯照射组相比，米诺环素可明显减轻射线对其克隆形成率的抑制，且随着射线剂量的提高，米诺环素的保护作用亦更明显。然后本研究继续检测电离辐射作用下HT22细胞的周期变化情况，发现X射线作用后24 h诱导细胞发生了G2/M期阻滞，而米诺环素可加剧细胞G2/M期的阻滞，使得更多细胞在进入下一次有丝分裂期之前获得时间进行自我修复。接着以53BP1 foci为指标观察HT22细胞的DNA双链断裂DSBs修复情况，不同剂量X射线照射后，53BP1 Foci阳性细胞数明显增加（剂量依赖性），然而米诺环素处理组与单纯照射组相比较，其53BP1 foci阳性细胞百分比未见明显统计学差异，提示米诺环素并没有通过修复射线所引起的DSBs来发挥其对HT22细胞的保护作用。另外通过对DNA损伤应激相关蛋白ATM和γ-H2AX的检测，发现米诺环素抑制了X射线照射诱导的各时间点ATM的磷酸化和γ-H2AX的表达水平，也证实米诺环素的神经保护作用与促进DNA损伤修复无关。　　3、检测电离辐射作用后不同时间点HT22细胞凋亡水平的变化，发现照后24 h，不同剂量X射线作用均未诱导明显的细胞凋亡，与对照相比无明显统计学差异，且米诺环素未见明显保护作用；照后48和72 h，照射导致的细胞凋亡水平明显提高，呈时间、照射剂量依赖性，而加入米诺环素组其细胞凋亡率可降低至单纯照射组的一半。　　接着发现X射线作用后可激活细胞内在自噬通路，流式结果显示照后48 h，8和12 Gy X射线明显激活HT22细胞体内的自噬通路，自噬阳性细胞百分比由（1.4±0.3）%提高至（10.8±0.7）%或（15.1±0.8）%，而加入米诺环素后可进一步将胞内自噬水平提高约74%或64%。接下来，我们使用自噬抑制剂3-MA抑制HT22细胞内的自噬后检测其凋亡水平，发现射线照射HT22细胞后48 h细胞内自噬被抑制，但与单纯照射组相比其细胞凋亡率明显提高。另外Cleaved-caspase3、LC3等蛋白的Westen Blot结果进一步确证了米诺环素可通过促进照射诱导的自噬来抑制射线所诱导的细胞凋亡。　　4、接着本研究发现AMPKα1通路参与介导了米诺环素的保护作用。首先PCR结果显示在HT22细胞中高表达AMPKα1而不表达AMPKα2。Western Blot结果显示射线照后24 h AMPKα1即可被激活，磷酸化蛋白表达上调，此时米诺环素未见明显作用；照后48 h AMPKα1持续激活，米诺环素可促进胞内AMPKα1进一步磷酸化，且该作用至少可持续至照后72 h。　　5、本研究继续探讨射线作用下米诺环素对于HT22细胞内AMPKα1通路、自噬以及凋亡之间的相互关系。首先使用AMPK激活剂A769662处理HT22细胞，发现照后48 h, A769662促进了HT22细胞内AMPKα1的磷酸化，同时促进了射线诱导的自噬水平提高，LC3 II蛋白表达水平上调，Cleaved-caspase3表达下调，细胞凋亡明显受抑制。接着本研究采用慢病毒shRNA感染细胞干扰胞内AMPKα1的表达继续实验发现， X射线作用48 h， shRNA明显抑制了HT22细胞胞内AMPKα1的表达，使得胞内AMPKα1的激活明显减少，射线诱导的细胞自噬阳性细胞百分比显著降低，米诺环素对自噬的促激活作用消失，此时慢病毒shRNA A敲低胞内AMPKα1的表达，米诺环素对受照HT22细胞凋亡的抑制作用几乎消失；而shRNA B感染细胞后，米诺环素对受照HT22细胞凋亡的抑制作用降低约60%。由此我们推测，米诺环素主要通过促进激活AMPKα1介导的自噬通路来抑制X射线诱导的HT22细胞凋亡。Western Blot结果进一步验证了上述结论。　　6、最后本研究探究米诺环素的抗氧化性与其对射线作用下HT22细胞的保护作用之间的关系。实验发现米诺环素与抗氧化剂过氧化氢酶Catalase和NAC均明显降低受照后1 h细胞内ROS水平。然而Catalase和NAC对射线诱导的AMPKα1的激活、胞内的自噬水平并无明显影响，但对射线诱导的细胞凋亡有降低趋势，然而没有统计学差异(catalase P=0.690，NAC P=0.073 vs CTR)。由此推测，米诺环素对受照HT22细胞的抗凋亡作用可能部分来自于其抗氧化作用。　　结论：　　1、米诺环素对受照的原代培养的神经元和HT22神经元细胞系均有保护作用。　　2、米诺环素可增强HT22细胞在X射线照射后的细胞存活能力，该作用可能与米诺环素加剧放射诱导的G2/M期阻滞有关，而与DSBs的修复无关。　　3、米诺环素主要通过激活HT22细胞内的AMPKα1介导的自噬通路来抑制X射线诱导的细胞凋亡从而发挥其神经保护作用。　　4、米诺环素对受照HT22细胞的抗凋亡作用可能还与其抗氧化作用有关。