目的：　　年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)又称老年黄斑变性，能够导致中心视力不可逆性丧失，是一种重要的致盲眼底性疾病。AMD分为湿性和干性，两种AMD在不同病程时期与视网膜色素上皮细胞(RPE)的萎缩、死亡与炎症，氧化应激等有着密切的关系，因此，研究在RPE细胞中具有抗炎、抗氧化作用的潜在的药物具有十分重要的意义。本课题组前期研究发现低剂量可逆性泛素-蛋白酶体抑制剂MG-132在ARPE-19细胞中通过激活PPAR-α(proliferation-activated peroxisome receptor alpha)途径起到抗炎、抗氧化作用，但是相对性的低剂量不可逆性泛素-蛋白酶复合体抑制剂在RPE中的抗炎、抗氧化机制不清，本课题选用两种常用的不可逆性蛋白酶-复合体抑制剂LA(clasto-lactacystinβ-lactone)和Epo(epoxomicin)，研究在低剂量时其抗炎、抗氧化的机制，从而为AMD的治疗提供潜在的新的理论依据。　　方法：　　1.检测LA/Epo对ARPE-19细胞的保护作用　　(1)细胞活性增殖实验(MTS)　　用不同低剂量的LA或Epo处理ARPE-19细胞18 h后，再用VK3(20μM)/HNE(15μM)处理18h，加MTS检测试剂，孵育2-4 h后检测吸光度。　　(2)细胞凋亡实验　　因为MTS值高低不仅可以反应细胞凋亡情况的变化，也可反应细胞增殖情况的变化，本部分通过检测细胞提取物中的Caspase-3来证明MTS值在本实验情况下与细胞的凋亡情况是否正相关。　　2.泛素-蛋白酶体活性检测实验　　用不同浓度的LA或Epo处理ARPE-19细胞后，用非变性细胞裂解液裂解细胞并收集蛋白。在Ex380 nm，Em440 nm下检测荧光值，用荧光值与蛋白质的比值来表示蛋白酶体的活性。　　3.泛素-蛋白酶体抑制剂激活自噬途径及原理分析　　(1) Western Blot实验　　用保护剂量的LA/Epo处理ARPE-19细胞18～24 h后，提取蛋白质，检测自吞噬相关蛋白ATG5、ATG7、LC3Ⅰ，LC3Ⅱ、p62的含量;并检测PI3-AKT-mTOR、通路相关蛋白。　　(2)免疫荧光共聚焦实验　　ARPE-19种植到poly-D-lysine包被的载玻片上，用1μM LA或者10 nM Epo预处理细胞18～24 h，进行溶酶体染色以及免疫荧光实验标记LC3抗体，染细胞核及封片后在共聚焦荧光显微镜下进行观察拍片。　　(3) ATG7敲减实验及后续细胞活性增殖实验　　接种适量的细胞于6孔板中，采用75 nmol/L siRNA转染ARPE-19细胞，6～8h后换成完全培养基;转染后72 h收集蛋白，测定ATG7的蛋白表达水平。与转染ATG scramble siRNA对比，在ATG敲减的细胞中，检验低剂量的LA或EPO抵抗VK3毒性的变化。　　结果：　　1.低剂量Epo可以减少由于4-HNE/VK3引起的氧化损伤，起到保护ARPE-19细胞的作用，并且这种保护作用可以被自噬抑制剂Baf所逆转。同样，低剂量的LA对ARPE-19细胞的保护作用也可以被Baf逆转。　　2.低剂量的LA或Epo预处理ARPE-19细胞后，均能够增加自噬相关蛋白ATG5、ATG7的表达，并增加LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转换;在低剂量时，减少p62的蛋白水平，高剂量时逆转p62的蛋白水平。该保护剂量的LA或EPO抑制PI3-AKT-mTOR通路，减少p-mTOR、p-AKT蛋白表达水平。　　3.免疫荧光共聚焦实验结果显示，LA或Epo处理ARPE-19细胞后诱导LC3与溶酶体共定位区域增加。采用siRNA对ATG7蛋白敲减后进行MTS实验，发现低剂量LA和Epo处理后， ATG7敲减后的细胞抗氧化保护作用明显下降。　　结论：　　低剂量的Epo或LA能够抵抗4-HNE/VK3引起的氧化损伤，起到保护ARPE-19细胞的作用。LA或Epo对细胞的这种保护作用可以被自噬抑制剂Baf逆转;并且LA或Epo均能使自噬相关蛋白表达水平上升，敲减ATG7减少LA或EPO的保护作用，说明LA或Epo抗氧化性损伤部分是通过激活自噬途径，而且可能是通过抑制PI3K/Akt/mTOR途径来激活自噬。本课题从新的角度探讨了低浓度泛素-蛋白酶体抑制剂对ARPE-19细胞的抗炎、抗氧化保护作用，该研究为AMD的治疗提供了新的理论依据，也为低浓度蛋白酶体抑制剂作为一种新的抗炎、抗氧化药物提供了理论依据。