论文部分内容阅读
背景肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一严重危害人类健康。肝癌的发病机制很复杂,表观遗传学改变调控的wnt/β-catenin信号通路相关基因失活在肝癌发生中发挥了重要作用。Dact (Homo sapiens dapper, antagonist ofβ-catenin)是wnt/β-catenin信号通路的负性调节基因家族。有研究表明Dactl和Dact3的表达分别受DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传学调控,具有抑制肿瘤发生的作用。但Dact2与肿瘤的关系研究文献报道很少,在肝癌中的表观遗传学变化及功能尚不清楚。目的1.检测Dact2在永生化肝细胞系和肝癌细胞系中的表达及甲基化改变。2.检测Dact2在正常肝组织、癌旁组织及不同分化程度肝癌组织中的表达及意义。3.检测Dact2在肝癌组织中的甲基化改变。4.探讨肝癌组织中DNA甲基化与Dact2表达之间的关系。5.检测Dact2对肝癌细胞生长的影响。6.探讨Dact2抑制肝癌细胞生长的可能机制。方法1. RT-PCR和Western blot检测细胞系中Dact2在甲基转移酶抑制剂5-aza-dc处理前后mRNA及蛋白的表达。2.甲基化特异性PCR (methylation specific PCR, MSP)检测细胞系和组织标本DNA中Dact2甲基化情况。3.免疫组织化学方法检测Dact2在正常肝组织、癌旁组织及不同分化程度肝癌组织中的表达分布。4.脂质体法转染Dact2真核表达载体,流式细胞分选结合G418筛选瞬时转染Dact2的细胞。5.克隆形成实验及BrdU掺入标记方法分析Dact2对细胞生长的影响6. Hoechst 33258染色分析Dact2对细胞凋亡的影响。结果1. Dact2在肝癌细胞系中的表达及甲基化改变本课题选用5株肝癌细胞系：HepG2、SNU449、SMMC7721、SNU182、PLC-PRF-5和一株永生化的肝细胞系Lo.2。在mRNA水平,Dact2在SNU449细胞系中无表达,在HepG2、SNU182、SMMC7721表达较弱,在Lo.2和PLC-PRF-5细胞中表达正常；5-aza-dc处理后,HepG2、SMMC7721、SNU182细胞中Dact2较未处理时表达上调,而LO.2、PLC-PRF-5和SNU449中Dact2无改变。选取HeoG2和SNU182两株细胞系检测Dact2蛋白的表达,结果显示Dact2蛋白在5-aza-dc处理后上调,与mRNA水平的表达改变一致。MSP检测结果显示lo.2和PLC-PRF-5中Dact2为非甲基化,HepG2、SNU449、SMMC7721、SNU182细胞系中存在甲基化改变,其中,SNU182、SNU449和SMMC7721细胞中同时有甲基化和非甲基化条带。Dact2启动子甲基化改变与基因表达呈对应关系。2. Dact2在肝癌组织标本中的表达及甲基化情况在表达部位上,Dact2在正常肝组织、癌旁组织和癌组织中表达均在细胞浆；在表达强度上,肝癌组织内Dact2表达较癌旁明显减低,两组比较有统计学意义(P<0.001)；在高分化和中分化肝癌组织中Dact2的表达显著高于低分化组(P＜0.05),而与患者的年龄、姓别、肿瘤大小及HBV相关性肝癌无显著相关。38例肝癌组织中的Dact2甲基化率为60.5%；在16例表达下调的肝癌标本中检测到Dact2甲基化的有11例(68.75%)。3.恢复Dact2表达对肿瘤细胞生长的影响克隆形成实验结果显示恢复Dact2表达后hepG2细胞的克隆数量明显少于对照转染的空载体,Dact2对细胞长期生长抑制作用大于空载体的2倍。Brdu掺入标记后转染Dact2的阳性细胞为39.63%,明显少于空质粒组48.32%,两组比较有显著差异(P<0.05)。4. Hoechst 33258染色分析Dact2对细胞凋亡的影响转染Dact2后HepG2的凋亡率为10.9%,而转染空质粒的凋亡率4.9%；SNU449细胞转染Dact2后细胞凋亡率为12.30%,转染空质粒的凋亡率12.10%,提示Dact2对细胞凋亡无明显影响。结论本课题检测了肝癌中Dact2的表达及DNA甲基化改变,5-aza-dc处理细胞系能恢复dact2的表达,表明在肝细胞癌中Dact2的表达受表观遗传学调控；恢复表达Dact2能够明显抑制肝癌细胞的增殖,但对凋亡无明显影响。以上结果为进一步研究Dact2在肝癌诊断和靶向治疗中的作用奠定了基础。