纤维素降解细菌新种的酶学特性及基因组文库构建策略

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当前,随着全球人口的增长及对不可再生资源的大量消耗,资源利用危机已经显露端倪。纤维素物质作为自然界中最为丰富的有机物质及可再生资源,因其具有充足的供应及低廉的价格,所以对其进行大规模的转化利用有着非常诱人的前景。然而,由于其具有高结晶的抗性构造,所以要把它水解成可利用的小分子单糖相当困难,因此直到目前为止纤维素物质仍没有得到非常广泛的转化利用。所以,当前针对纤维素物质资源的转化利用研究,已经在全世界范围内引起了高度的重视。  本文针对纤维素物质利用过程中所关注的热点问题,以纤维素降解细菌为研究对象,分别从纤维素降解微生物资源的开发、纤维素酶学特性分析以及菌株的基因组文库构建等角度进行了研究和论述。首先,利用梯度稀释法及平板画线纯化法分离到一株具有表达纤维素酶能力的细菌菌株,基于1440bp的16SrDNA序列比对分析后发现,分离菌株与Vibrioscophthalmi的亲源关系较为接近,其序列同源率为97.92%,表明菌株应为纤维弧菌属内的一个成员。在16S-23SrDNA间隔区(ISRs)序列中存在保守的tRNAala和tRNAile基因编码区,而在可变区中不具有同源序列,基因组中的G+Cmol%含量为53.07mol%,略高于弧菌属内的其它典型菌株。另外,菌株与其它高同源性及相近生理特性细菌之间在生理特性上也存在一些明显的差异。多项分类鉴定结果表明,所分离菌株在系统进化发育上应该是有别于弧菌属内其它典型细菌的一个新类型菌株。  菌株所表达的纤维素酶系统为诱导酶,其中包括CMCase、EG及BGL三种酶蛋白成分,其酶蛋白量在酶系中的比例接近3.1:1.4:1.0。纤维素酶系统发挥活性的最适pH为5.0至5.5,最适温度为50℃。Zn2+、Fe2+及Ca2+对于纤维素酶系统的活性有明显的促进作用,而Fe3+与Hg2+对于酶系统活性有非常强烈的抑制作用。菌株采用了不同的代谢机制完成对纤维素物质和可溶性糖的代谢。菌株以滤纸纤维素作为碳源的发酵过程中,体系中的还原糖量在初始阶段积累增加,但是随着代谢的进行还原糖量开始迅速降低,反应结束后体系中的还原糖量变得极其微少。酶系统中的羧甲基纤维素酶和滤纸纤维素酶组分主要定位在细胞外膜。  此外,分别采用四碱基位点识别限制酶Sau3AI和六碱基位点识别限制酶PstI作为工具酶,构建了菌株的Sau3AI和PstI双基因组文库。菌株高浓度基因组样品的制备、重组体构建过程中DNA片段的最佳连接比例及宿主菌株对重组体所具有的高感受能力为基因组文库的完整性构建奠定了坚实的基础。对双文库中随机挑取克隆子中的重组质粒进行酶切的结果显示,双文库中的重组体中都含有长度不等的外源基因片段,具备完整基因组文库应包含核酸序列片段多样性的要求。此外,双文库中的克隆子数目,符合L.Clarke和J.Carbon所提出的计算一个完整基因组文库所应该包含有实际克隆数的理论数值要求。
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