研究背景：　　 缺血性心脏病是全球高发的疾病之一，其本质是心肌细胞的不可逆丧失。目前临床积极进行溶栓，介入等再灌注治疗，但仍缺乏针对已经梗死心肌细胞再生的根本性治疗方法，梗死心肌形成无收缩功能的瘢痕组织，导致心功能的改变，最终导致心衰。干细胞的发现与再生医学的发展为心肌细胞的再生带来了新的希望。其中，成体骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)易于获取、扩增，具有多分化潜能，且免疫源性较低，甚至免疫抑制作用，是心肌细胞再生有前途的种子细胞。绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)作为活细胞的荧光标记，技术成熟，应用广泛。携带GFP的BMSCs转染率高，荧光便于观察，是体外活细胞示踪的安全、高效的理想标记。近年来，以五氮杂胞苷(5-azacytidine，5-aza)为先驱和代表，将BMSCs诱导分化为有功能、乃至有电活动的心肌细胞的研究始终在进行。新的诱导剂大致分为如下几类：①细胞因子类，如血管内皮生成因子，胰岛素样生长因子，肝细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子等；②炎性因子类如白介素-6，肾素，血管紧张素-Ⅰ，血管紧张素-Ⅱ等；③以及中医药类如黄芪甲甙，双地龙，丹参酚酮，淫羊藿等。　　 心肌营养素-1(cardiotrophin-1，CT-1)是白介素-6细胞因子家族的一员，最早发现其促进细胞肥大的作用，在先天性心脏病、心肌病、进行性心力衰竭和心肌梗死等病理过程中均有过度表达。而CT-1诱导大鼠BMSCs向心肌样细胞分化的研究亦有进行，其结果提示：CT-1可辅助5-aza提高诱导率，但未能独立将BMSCs诱导为心肌细胞。因此，本课题将研究CT-1在BMSCs诱导分化为心肌细胞中的作用，明确其诱导功效。　　 研究目的：　　 本研究旨在探索CT-1在诱导GFP转染的小型猪BMSCs向心肌样细胞分化中的作用，通过观察分化过程中的形态学变化、研究其生物学活性及增殖能力、摸索适宜的诱导条件、检测心肌细胞特异蛋白的表达，以明确CT-1是否对BMSCs的诱导分化过程有作用，并为携带CT-1基因的BMSCs体内移植并在体表达CT-1作为旁分泌因子刺激干细胞分化为心肌细胞提供理论和实验依据，且为移植后在体细胞的生长分化情况及其改善心功能中作用的观察提供实验准备。　　 研究方法：　　 1、获取、扩增稳定的成体西藏小型猪BMSCs，绘制生长曲线，鉴定成脂、成骨潜能　　 2、用携带GFP的逆转录病毒转染BMSCs，绘制生长曲线，鉴定成脂潜能　　 3、分组诱导分化　　 将携带绿色荧光蛋白的MSC分为：空白对照组，5-aza组，CT-1组，复合组，换诱导液作用24小时后，继续原条件培养28天。　　 4、免疫荧光检测以及计算荧光染色阳性率　　 取诱导后28天的细胞加肌动蛋白(a-actin)，心肌肌钙蛋白T(cardiac tropponinT，cTnT)一抗行免疫荧光染色，予罗丹明(Tetraethylrhodamine，TRITC)二抗，再行Hochest法染核。最后计数红色荧光阳性染色率。　　 5、统计分析：以SPSS13.0软件统计，每组检测结果以均数士标准差表示，以P＜0.05为具有统计学意义。　　 实验结果：　　 1、BMSCs的培养与鉴定　　 1.1原代BMSCs的培养与传代　　 一周后可见多个长梭形细胞集落，核圆居中，含1-3个核仁。约12天首次按2*10e4/cm2密度传代。　　 1.2 BMSCs的成骨、成脂诱导　　 取第四代细胞行成骨诱导21天后钙化结节茜素红染色阳性。成脂诱导14天行油红O染色，胞核周围红染。　　 2、慢病毒载体携带GFP基因转染的BMSCs2.1取第四代细胞行GFP转染，在荧光下观察可见表达绿色荧光的细胞约60-80％，转染后增殖速度较前变慢，2.2取第五代GFP-MSC进行成脂诱导，14天行油红O染色，胞核周围红染。　　 3、分组诱导　　 21天起，可见细胞生长减慢，细胞回缩变短，细胞聚集生长趋势，细胞排列具有明显的方向性，具有短棒状结构及位于中心的细胞核，核/浆比例明显降低，未见细胞搏动。以复合组变化最为明显。　　 4、免疫荧光染色　　 荧光显微镜下可见细胞核均显示蓝色荧光，约20％细胞显示绿色荧光。　　 a-actin红色荧光染色结果显示：复合组的诱导分化心肌样细胞a-actin阳性率为29.900±4.7571％，明显大于5-aza组(17.7333±2.3459％，p=0.000)、CT-1组(6.6333±0.55076％,p=0.000)和空白对照组(1.6167±0.08505％，p=0.000)；5-aza组明显大于CT-1组(p=0.000)和空白对照组(p=0.000)；CT-1组明显大于空白对照组(p=0.028)。　　 cTnT红色荧光染色结果显示：复合组的诱导分化心肌样细胞cTnT阳性率为36.500±4.0927％，明显大于5-aza组(14.366±1.6502％，p=0.000)、CT-1组(7.5000±0.60828％,p=0.000)和空白对照组(1.1167±0.22546％，p=0.000)；5-aza组明显大于CT-1组(p=0.000)和空白对照组(p=0.000)；CT-1组明显大于空白对照组(p=0.003)　　 结论：　　 1.适宜浓度(10umol/l)的5-aza能够在体外诱导携带GFP基因的BMSCs转化为心肌样细胞，诱导后的细胞获得部分心肌细胞特异性蛋白的表达。2.适宜浓度(0.1ng/ml)的CT-1能够在体外诱导携带GFP基因的BMSCs转化为心肌样细胞，诱导后的细胞获得部分心肌细胞特异性蛋白的表达，但诱导率低于5-aza组。　　 3.CT-1(0.1ng/ml浓度)与5-aza(10umol/l)复合提高诱导率。　　 4.经上述方案诱导后的细胞为心肌样细胞，未见自主搏动。　　 5.BMSCs体外培养传至第六代后，经28天贴壁培养，未见明确的自发性肌源化倾向。