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目的:自天然螺旋藻粉中纯化出高纯度藻蓝蛋白亚基;确定藻蓝蛋白亚基PDT致肿瘤细胞死亡的最佳剂量;制备鉴定纯化PRAS40-S183磷酸化多克隆抗体;探究PC亚基PDT介导细胞凋亡对凋亡相关蛋白PRAS40、LKB1表达量及磷酸化水平的影响。 方法:盐溶、盐析、离心、SEPHADEX G-75柱层析分离纯化藻蓝蛋白,紫外-可见分光光度计全波长扫描检测纯度,SDS-PAGE紫外检测亚基状态,透析除盐、冻干备用;正常培养人胚胎肾细胞HEK293、人肺癌细胞A549,以系列浓度PC亚基(0,25,50,75,100,125,150,200μg/mL)、30J/cm2光照处理上述细胞8min,MTT法检测细胞死亡情况,确定致非肿瘤细胞最大限度生存、肿瘤细胞最大限度死亡的最佳PDT剂量范围,在此范围内吖啶橙染色荧光显微镜观察计数确定致最大细胞凋亡率的最佳PDT剂量;通过蛋白疏水性抗原性分析设计多肽抗原,用其免疫家兔获得抗血清,ELISA检测其效价,用rProtein A Sepharose亲和层析纯化并经非磷酸化的抗原条吸附处理后的抗体,Western Blot法检测正常细胞HL7702、HEK293及肿瘤细胞HepG2、A549、S180,经饥饿处理HEK293细胞观察S183磷酸化水平变化;Western blot检测PC亚基PDT对A549细胞LKB1、PRAS40量变及磷酸化水平的影响。 结果:紫外可见分光光度计检测表明纯化出高纯度藻蓝蛋白,SDS-PAGE紫外显示为亚基混合物;MTT法得知低剂量PDT(PC亚基浓度25μg/mL)可以促进细胞生长;高剂量的PDT可以导致细胞死亡;在光照功率恒定的情况下,A549人肺癌细胞的半数致死PC亚基浓度约为60μg/mL,HEK293非肿瘤细胞的半数致死PC亚基浓度约为120μg/mL;最佳PDT剂量范围是光照30J/cm2,8min，PC亚基浓度75μg/mL和100μg/mL,以吖啶橙染色荧光显微镜观察计数计算得知,致高凋亡率最佳PDT剂量是光照30J/cm2,8min,PC亚基浓度100μg/mL;通过蛋白疏水性抗原性分析设计多肽抗原TQQYAKpS183LPV,用其免疫家兔获得抗血清,ELISA检测其效价为1:10000;用rProtein A Sepharose亲和层析纯化并经非磷酸化的抗原条吸附处理后的抗体,Western Blot法检测发现,该处理可以明显提高磷酸化抗体的特异性;对正常细胞HL7702、HEK293及肿瘤细胞HepG2、A549、S180的检测显示,磷酸化的Ser183在不同细胞中表达的差异不显著;而经细胞饥饿处理的HEK293细胞中却明显观察到了S183磷酸化水平随氨基酸含量的降低而减弱的现象;由Western blot知,随着细胞凋亡率改变,pT336-LKB1即失活LKB1的量未见明显变化,但是LKB1蛋白总量却与其成负相关,说明有正常功能的LKB1蛋白随着细胞凋亡的发生而量增,此与LKB1的性质相符合,伴随低剂量PDT作用导致的细胞增殖,正常LKB1的量也相应的减少,PRAS40蛋白总量未随PDT剂量增加而产生明显变化,伴随高剂量PDT导致细胞凋亡,S183位点的磷酸化出现减少,然而,在低剂量致细胞增殖的PC亚基PDT作用下,S183位点的磷酸化水平未出现明显变化。 结论:高剂量PC亚基PDT可以导致细胞凋亡,在此细胞凋亡中LKB1、PRAS40蛋白参与了调控,抑癌蛋白LKB1通过总量不变减少失活的T336位点磷酸化的LKB1来达到抑制细胞增殖导致凋亡,PRAS40通过去磷酸化自身S183位点达到抑制mTORC1进而促进凋亡的功效。低剂量的PDT可以导致细胞增殖,LKB1蛋白参与了该进程,其变化与促细胞凋亡相反。