目的:脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)是多因素参与引起的复杂病理过程,与许多眼底疾病视力严重损伤密切相关。然而,由于对CNV的认识起步较晚,其发病机制及临床诊断、治疗等方面尚存在很多亟待解决的问题。在CNV发生过程中,视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞起着重要的调控作用,脉络膜毛细血管内皮细胞是CNV发生的靶细胞。正常状态下,上述两种关键细胞间存在着一个重要的屏障,即Bruch膜。Bruch膜一旦破坏,各种刺激因素可直接或通过RPE细胞间接作用于脉络膜毛细血管内皮细胞,从而引发CNV。RPE-Bruch膜-脉络膜毛细血管复合体的改变与CNV的形成有关。研究发现,小分子G蛋白Ras超家族的成员Rap1对细胞粘附连接完整性、内皮细胞及上皮细胞屏障功能产生重要作用,且调节内皮细胞对一些促进血管新生刺激因素的反应。那么,Rap1是否可以通过调节视网膜色素上皮屏障的完整性从而对CNV的发生发展产生影响呢?Rap1在CNV中的表达情况及其与CNV形成的相关性尚不明确,有待于实验研究加以证明。本研究采用激光诱导建立大鼠CNV模型,分别从组织病理学及分子病理学角度观察Rap1、GTP-Rap1、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和β-连蛋白(β-catenin)在实验性CNV中的表达情况,验证GTP-Rap1是否通过介导β-catenin的改变来影响视网膜色素上皮屏障的完整性,探讨其在CNV发生发展过程中的分子机制。为今后以Rap1为靶向巩固视网膜色素上皮屏障的完整性,提供研究基础。方法:1实验性脉络膜新生血管中Rap1表达的研究1.1 8-10周健康棕色挪威(Brown Norway,BN)大鼠30只,雌雄不限,双眼前节及眼底检查均正常,随机分为6组,每组5只,10只眼。分别为空白对照组、激光后3d组、激光后7d组、激光后14d组、激光后21d组、激光后28d组。1.2 CNV模型的建立:除空白对照组外,其他各组大鼠均采用氪激光建立CNV模型。参数:波长647nm、光斑直径200μm、功率260m W、曝光时间0.05s,围绕视盘均匀光凝9~10个点,以见到有气泡产生提示Bruch膜被击穿为标志。1.3分别于光凝后第3、7、14、21、28d进行荧光素眼底血管造影(fluorescein fundus angiography,FFA),活体观察CNV的形成情况,测定CNV的发生率。1.4光凝后第3、7、14、21、28d造影后处死大鼠,摘除眼球取眼后段组织制作石蜡切片。选取有明确血管化的激光斑处做切片,常规HE染色光镜观察各组标本视网膜脉络膜的组织形态学改变,免疫组织化学法检测Rap1的表达情况。1.5图像分析与统计学处理采用SPSS19.0软件对所得各时间点显微镜下阳性染色率进行分析,观察正常组织中Rap1及各时间点光凝组织中Rap1的表达差异。2实验性脉络膜新生血管中Rap1、GTP-Rap1、VEGF、β-catenin表达的研究2.1 8-10周健康棕色BN大鼠30只,双眼前节及眼底检查均正常,随机分为6组,每组5只,10只眼。分别为空白对照组、激光后3d组、激光后7d组、激光后14d组、激光后21d组、激光后28d组。除空白对照组外,其他各组大鼠均采用氪激光建立CNV模型。参数:波长647nm、光斑直径200μm、功率260m W、曝光时间0.05s,围绕视盘均匀光凝9~10个点,以见到有气泡产生提示Bruch膜被击穿为标志。2.2分别于激光后3、7、14、21、28d,随机选取各组大鼠2只、4只眼,采用Western Blot蛋白水平检测Rap1、GTP-Rap1、VEGF及β-catenin的表达情况。2.3分别于激光后3、7、14、21、28d,选取各组剩余大鼠,每组3只、6只眼,行Real-Time PCR方法检测各组实验性CNV中Rap1、GTP-Rap1、VEGF及β-catenin基因的m RNA转录水平的变化情况。2.4采用SPSS19.0软件对所得数据进行统计学分析。结果:1实验性脉络膜新生血管中Rap1表达的研究1.1 FFA检查:激光后14d光凝区出现大片圆盘状荧光素渗漏;激光后21d有荧光渗漏的光凝斑数达到高峰;激光后28d荧光渗漏光凝斑数无明显增加。1.2光镜观察:激光后7d发现光凝区形成早期的CNV;激光后21d,CNV呈显著的纤维血管增殖,可见大量新生血管生成。1.3 Rap1在激光后3~28d的表达情况与空白对照组均为弱阳性表达,且无明显变化,主要见于视网膜内核层、外核层、视网膜色素上皮层、脉络膜血管内皮细胞胞浆、胞核。并且各组显微镜下统计阳性细胞个数及阳性细胞显色分级,进行数据分析无统计学意义。2实验性脉络膜新生血管中Rap1、GTP-Rap1、VEGF、β-catenin表达的研究2.1 Western Blot检测结果:空白对照组Rap1表达情况与激光后不同时间点对比无明显变化;空白对照组GTP-Rap1表达情况与激光后不同时间点对比明显减少,且呈下降趋势;VEGF在激光后7d、14d表达明显增多,激光后21天达到表达高峰;激光后不同时间点各组中β-catenin的表达较空白对照组明显增多,呈上升趋势改变。组组之间采用pearson相关性检验,GTPRap1相对表达量与VEGF基因相对表达量的相关系数为:-0.956,为高度相关;与β-catenin基因相对表达量的相关系数为:-0.961为高度相关。2.2 Real-Time PCR结果显示:Rap1在空白对照组及激光后各组中的表达不变。各组GTP-Rap1、VEGF及β-catenin基因数据均符合方差齐性和正态性分布。光凝后7d、14d、21d、28d,各组中GTP-Rap1、VEGF与空白对照组存在差异,均有统计学意义。空白对照组中β-catenin与激光后不同时间点的表达差异均有统计学意义。组组之间采用pearson相关性检验,GTP-Rap1相对表达量与VEGF基因相对表达量的相关系数为:-0.913,为高度相关;与β-catenin基因相对表达量的相关系数为:-0.929为高度相关。结论:1 Rap1在正常组织及实验性CNV中的表达情况无明显改变,真正对视网膜色素上皮屏障功能起到调节作用的是活化的Rap1。2 GTP-Rap1在实验性CNV中表达情况较正常大鼠明显减少,与CNV的形成及发展存在相关性。3由于GTP-Rap1与VEGF、β-catenin表达呈负相关,我们推测激活Rap1在保持视网膜色素上皮屏障完整性及脉络膜血管内皮细胞迁移中有重要的调控作用。