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前言 外阴癌是妇科恶性肿瘤之一，常见于60岁以上的妇女。外阴鳞状细胞癌是外阴癌最常见的类型，占所有外阴恶性肿瘤的90％以上。目前外阴癌的病因仍不清楚，危险因素包括外阴营养不良（如外阴硬化性苔藓）、外阴人乳头瘤病毒感染史、吸烟、外阴上皮内瘤变、免疫缺陷综合征及宫颈癌的病史等。随着分子生物学研究进展，研究发现一些与外阴癌变相关的基因和蛋白，但确切的机制尚不清楚。 蛋白质组学是指以蛋白质组为研究对象，从整体的角度，分析细胞内动态变化的蛋白质组成与活动规律。与传统的单个蛋白质研究相比，蛋白质组学采用高通量的研究方法，可同时筛选多个蛋白质，在研究有关生命活动机制的基本问题方面达到了空前的规模和速度。因此，本研究利用蛋白质组学研究技术即2D-DIGE（双向荧光差异凝胶电泳）结合MALDI-TOF/TOF（基质辅助激光解吸电离）质谱鉴定的方法筛选外阴鳞癌组织及外阴正常组织之间差异表达的蛋白质，同时运用Western blotting及免疫组化的方法对部分差异表达蛋白质进行验证，并将检测的结果与临床病理资料相结合进行研究，最后通过甲基化研究分析外阴鳞癌组织及外阴正常皮肤组织中Galectin-7基因启动子甲基化的情况。 实验方法 一、蛋白质组学 （一）总蛋白的提取、纯化及定量 收集外阴鳞癌组织及外阴正常组织各6例进行总蛋白质的提取。按照2DClean-up Kit蛋白质纯化试剂盒的说明书对总蛋白质进行提纯。按照2D Quant Kit蛋白质定量试剂盒的说明书进行总蛋白质浓度的测定。 （二）双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)及图像分析 对提取的总蛋白进行荧光标记后进行第一向固相pH梯度等电聚焦，然后将胶条进行平衡后进行第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。将电泳后的胶板进行扫描后进行分析。 （三）MALDI-TOF（基质辅助激光解吸电离）质谱鉴定及生物信息学分析 凝胶样品的制备及点样后置于质谱仪中进行鉴定，通过查询EMBL-EBI数据库对筛选出的蛋白质进行生物信息学分析。 二、免疫组化 应用免疫组织化学SP法分析35例外阴鳞癌组织及10例外阴正常皮肤组织中Galectin-7，GSTP1，Prx4，CFL1，Pfn1及DPT的表达情况。 三、Western blotting 应用Western blotting技术检测10例外阴鳞癌组织及外阴正常皮肤组织中Galectin-7，GSTP1，Prx4，CFL1，Pfn1及DPT的表达。 四、临床病理资料分析 对外阴鳞癌组织的免疫组化检测结果与外阴鳞癌病例的临床病理特征之间的关系进行研究。 五、甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP) 应用MSP的方法对20例外阴鳞癌组织及12例外阴正常皮肤组织中Galectin-7基因启动子甲基化的情况进行检测。 实验结果: 1、双向荧光差异凝胶电泳中切取差异明显的蛋白质点78个，其中共有66个得到鉴定结果。除去重复的蛋白质，最终得到62个差异蛋白质。其中，在外阴鳞癌组织中表达上调的蛋白质为54个，表达下调的蛋白质为8个。 2、通过查询EMBL-EBI数据库获得62个差异蛋白的生物学功能及亚细胞定位。差异蛋白质的生物学功能多样，其中主要包括凋亡(14.52％)，转录与翻译(12.90％)，信号转导(9.68％)，免疫反应(8.06％)，代谢酶(9.68％)，转运(12.90％)。对62个差异蛋白的亚细胞定位进行分析，其中30个位于胞浆(49.21％)。 3、免疫组化检测发现Galectin-7，GSTP1，Prx4，CFL1，Pfn1，DPT阳性细胞均表达于外阴正常表皮细胞全层，呈细胞浆和细胞核阳性，在VSCC癌巢中有阳性细胞表达（其中DPT在VSCC癌巢细胞中无表达或弱表达），而间质中无表达，并且两者之间均有显著性差异(P＜0.05)。其中GSTP1，Prx4，CFL1，Pfn1在外阴鳞癌组织中显著高表达(P＜0.05)，Galectin-7及DPT在外阴鳞癌组织中显著低表达（P＜0.05）。 4、Western blot检测结果显示高分化外阴鳞癌组织中Galectin-7及DPT的表达明显低于外阴正常皮肤组织(P＜0.05);高分化外阴鳞癌组织中GSTP1，Prx4，CFL1及Pfn1的表达明显高于外阴正常皮肤组织(P＜0.05)。 5、甲基化特异性PCR检测外阴鳞癌组织及外阴正常皮肤组织中Galectin-7启动子的甲基化情况发现在外阴鳞癌组织中Galectin-7启动子甲基化的阳性率为80.0％，在外阴正常皮肤组织中甲基化的阳性率为33.3％，两者具有统计学差异(P＜0.05)。 结论: 1、运用蛋白质组学技术共筛选出62种差异蛋白，其中54种蛋白质在外阴鳞癌组织中表达上调，8种蛋白质在外阴鳞癌组织中表达下调。 2、通过验证实验发现GSTP1，Prx4，CFL1及Pfn1在外阴鳞癌组织中显著高表达，Galectin-7及DPT在外阴鳞癌组织中显著低表达。其表达趋势和前期蛋白质组学研究结果相一致。 3、在有淋巴结转移、临床分期高及分化低的外阴鳞癌病例中，Galectin-7，GSTP1，Prx4及CFL1均表达上调，而DPT的表达下调。Pfn1在有淋巴结转移、临床分期高的病例中高表达。 4、Galectin-7基因启动子的甲基化与外阴鳞状细胞癌的癌变有关。