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第一部分mi R-365在自然流产蜕膜中的表达分析及其对滋养层细胞凋亡的影响目的:探究mi R-365在自然流产中的表达情况及其对滋养层细胞凋亡的影响。方法:应用mi RNA芯片技术,筛选自然流产蜕膜中差异表达的mi RNA,使用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)对芯片结果进行验证;利用p53-和MDM2-promoter荧光报告系统,筛选影响p53和MDM2活性的mi RNAs;构建mi R-365过表达慢病毒载体,转染HTR-8/SVneo细胞后,运用q RT-PCR和蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)技术分别检测p53和MDM2m RAN和蛋白表达水平,流式细胞术检测不同时间点细胞凋亡情况,透射电子显微镜观察细胞超微结构变化。结果:从自然流产蜕膜中筛选出7个上调mi RNAs和10个下调mi RNAs,其中mi R-365既可以使MDM2活性明显降低(P<0.01),又能使p53活性明显升高(P<0.01);MDM2 m RNA和蛋白水平在过表达mi R-365的HTR-8/SVneo细胞中均显著下调(P<0.01),而p53 m RNA和蛋白水平显著上调(P<0.01),且均具有时间依赖性;流式细胞计数和透射电子显微镜的结果均显示,过表达的mi R-365以时间依赖性的方式诱导细胞凋亡。结论:自然流产蜕膜中存在诸多差异表达的mi RNA,提示mi RNA可能参与自然流产的发生;mi R-365的上调表达促进滋养细胞的凋亡,提示自然流产蜕膜中高表达的mi R-365可能通过增加滋养细胞的凋亡而参与自然流产的发病过程。第二部分mi R-365调控SGK1信号通路影响滋养层细胞凋亡机制的初步论证目的:探讨mi R-365、SGK1与滋养层细胞凋亡之间的相互关系。初步阐明mi R-365介导SGK1致滋养层细胞凋亡的可能分子机制。方法:利用生物信息学分析,预测mi R-365的潜在靶标;构建mi R-365过表达细胞模型,q RT-PCR检测候选靶基因的变化,并使用生物信息学分析进行保守性和同源性预测;构建SGK1和SGK3 3’-UTR萤光素酶报告系统,筛选mi R-365靶基因;应用q RT-PCR和WB检测自然流产和人工流产蜕膜中SGK1 m RNA和蛋白表达水平;使用Pgenesil-1-SGK1-sh RNA质粒转染HTR-8/SVneo细胞,流式细胞计数检测不同时间点细胞凋亡情况,透射电子显微镜观察滋养层细胞的超微结构变化;构建mi R-365和SGK1过表达慢病毒载体,共转染HTR-8/SVneo细胞,q RT-PCR和WB检测p53和MDM2 m RNA和蛋白表达水平,流式细胞计数检测细胞周期和凋亡,透射电子显微镜观察滋养层细胞的超微结构变化。结果:在筛选的候选靶基因中,过表达mi R-365可显著抑制SGK1、SGK3的表达(P<0.01),而对MAP3K13、MAPK2、MAPK11P1L影响不大,且mi R-365与SGK1、SGK3的互补结合序列在进化上高度保守、同源性达100%;过表达mi R-365可显著抑制SGK1 3’-UTR报告系统的萤光素酶活性(p<0.01),而对SGK3的活性无显著影响;自然流产蜕膜中SGK1 m RNA和蛋白水平均显著下调(p<0.01),与mi R-365的表达呈负相关;流式细胞计数和透射电子显微镜结果显示,沉默SGK1以时间依赖性的方式诱导细胞凋亡;SGK1过表达可以逆转mi R-365过表达对p53和MDM2 m RNA和蛋白表达影响,以及对滋养层细胞凋亡的影响。结论:mi R-365靶向结合SGK1 3’-UTR序列,调控SGK信号通路的关键分子SGK1;SGK1基因敲除的效果与mi R-365过表达在调控滋养层细胞凋亡中的效果相似,提示SGK1可作为mi R-365的一个功能性的靶点;过表达的SGK1可以逆转mi R-365过表达对MDM2和P53诱导的细胞凋亡的影响,提示mi R-365在自然流产中的作用可能通过SGK1介导滋养细胞凋亡来实现。