解决大面积深度烧伤创面快速、永久性覆盖问题以及如何促进慢性创面愈合，从而减轻伤员的痛苦、提高创面愈合质量和降低社会医疗负担等方面有着重要的现实意义。近二十年来，皮肤组织工程和干细胞的研究进展为创面的修复提供了新思路。但是，目前研制的组织工程皮肤不但价格昂贵，而且功能缺陷，不能实现皮肤完美修复。人们发现，真皮重建能提高创面的愈合质量，要实现组织工程皮肤的完美修复，首先从构建功能完备的真皮入手。真皮组织结构复杂，必须选择增殖、分化潜能旺盛的干细胞为种子细胞来重建真皮。组织中的干细胞数量少，干细胞的特性难以维持。因此选择何种干细胞以及如何简便快捷地获取足够用量的干细胞是皮肤组织工程重要研究方向之一。本课题研究不同年龄组人真皮多能干细胞的分离方法及体外分化特点；依据干细胞克隆增殖潜能、多向分化、不易老化的生理特性进行鉴定；探索干细胞特别是老年人皮肤来源的多能干细胞的体外扩增方法；在此基础上，以人血浆为支架，以真皮多能干细胞为种子细胞，构建真皮再生模板，观察其对全层皮肤缺损创面愈合的影响；为以后选择合适的种子细胞构建组织工程皮肤或自体细胞移植用于创面修复提供理论依据和方法。 第一部分.不同年龄组人真皮多能干细胞的分离、鉴定及体外分化特点 [目的]研究不同年龄组人真皮多能干细胞的分离、鉴定及体外分化特点。[方法]取5例胎儿、5例小儿、6例成年人、6例老年人正常皮肤标本，采用限制性干细胞培养基筛选克隆并记录克隆的数量和大小；检测不同年龄供体克隆细胞的分子标志物nestin、fibronectin、c-Myc、STAT3、TERT、E-Cadherin、Vimentin及PCK蛋白和体外分化情况并定量；筛选的克隆细胞进行单克隆分析；克隆细胞植入裸鼠皮下，观察有无致瘤性。[结果](1)胎儿、小儿、成年人、老年人1cm2皮肤原代培养获得的悬浮克隆个数分别为(20.1±2.5)×102、(15.8±5.7)×102、(10.8±1.29)×102、(6.25±1.37)×102；胎儿＞小儿＞成年人＞老年人。原代克隆直径分别为(83.33±12.11)μm、(55.45±10.11)μm、(45.71±11.70)μm、(42.14±8.09)μm；胎儿＞小儿＞成年人、老年人。(2)各组克隆细胞均能向神经元细胞、神经胶质细胞、平滑肌细胞和脂肪细胞分化；定量分析发现胎儿、小儿和成年人、老年人克隆细胞分别向神经元细胞、神经胶质细胞、脂肪细胞优势分化。(3)上述悬浮克隆的单个细胞具有克隆形成能力；单克隆增殖细胞亦能多向分化。(4)免疫荧光细胞化学检测发现，克隆团明显表达nestin、fibronectin、c-Myc、STAT3及TERT蛋白。流式细胞分析术发现98.5±1％的克隆形成细胞表达nestin及95.2±1.3％的细胞表达fibronectin；克隆形成细胞不表达E-Cadherin、Vimentin、NSE、GFAP及PCK蛋白。(5)细胞活体植入无致瘤性。[结论]不同年龄组人真皮中具有克隆增殖和多向分化的干细胞采用限制性干细胞培养基能够有效分离；年龄对人真皮多能干细胞的数量、增殖、分化有影响。 第二部分.老年人真皮多能干细胞的体外有效扩增 [目的]探讨老年人真皮多能干细胞体外有效扩增方法。[方法]取6例老年人皮肤标本，胰酶消化，采用限制性干细胞培养基和含血清的培养液交替培养进行克隆筛选和扩增传代；利用免疫细胞化学技术、克隆分析、细胞5-溴脱氧尿嘧啶掺入来评价扩增细胞的生理特性。[结果](1)1cm2大的老年人皮肤原代获得400-600个细胞克隆；有效扩增后可获得(2-3)×105个细胞克隆/代。(2)克隆细胞体外可向神经细胞、胶质细胞、平滑肌细胞和脂肪细胞分化；单细胞克隆形成率约20％，也能向上述细胞分化；克隆细胞的细胞核掺入5-溴脱氧尿嘧啶。(3)细胞克隆明显表达nestin、fibronectin、c-Myc、STAT3及TERT蛋白。流式细胞分析术发现，克隆形成细胞不表达E-Cadherin、Vimentin、NSE、GFAP及PCK蛋白。[结论]限制性干细胞培养基和含血清的培养液交替培养是老年人皮肤多能干细胞分离和扩增的有效方法；扩增的细胞仍维持原代的特性。 第三部分.真皮多能干细胞复合血浆构建真皮再生模板及移植观察 [目的]以人真皮多能干细胞为种子细胞构建真皮再生模板，观察移植后成活状态。[方法]5-BrdU标记的真皮多能干细胞接种0型血浆中构建真皮模板并作组织学观察；裸鼠背部制作全层皮肤缺损创面，真皮模板移植后3、6、9天取材观察血管化程度；创面上皮化后第1、3周取材，免疫组织化学检测模板中标记细胞的成活状态。[结果](1)干细胞在血浆中增殖良好；真皮模板为白色生物膜，厚约(500±254)μm。(2)真皮模板中部分细胞仍表达nestin；(3)真皮模板植入后第3天，模板下有少量的血管生成；第9天大量细胞迁入模板中。(4)创面上皮化后第1、3周，皮肤组织的表皮和真皮中可见大量的5-BrdU阳性细胞分布。[结论]真皮多能干细胞接种于血浆中构建的真皮模板移植后能较快的血管化；真皮模板细胞在受体组织中能成活下来。 第四部分.真皮再生模板对全层皮肤缺损创面愈合的影响 [目的]观察真皮再生模板对皮肤创面愈合质量的影响。[方法]分离培养鼠的真皮多能干细胞；以血浆为载体构建真皮再生模板；60只裸鼠背部制作皮肤缺损创面，随机平分为真皮模板移植组(A组)、单纯血浆支架组移植(B组)和空白组(C组)，记录创面愈合时间；创面愈合后第2天，用透明膜描绘法估计创面的挛缩程度；创面愈合后第1周取材，测量皮肤的机械性能；HE染色，光镜下测量表皮的厚度；分别在创面愈合后第1、2、4、8周取材进行组织学观察；免疫荧光检测表皮下及真皮层PGP9.5的表达，以此反映皮肤神经再生情况。[结果](1)A组、B组、C组创面愈合时间分别为(15.7±1.0)d、(19.7±1.44)d、(20.5±1.2)d；A组愈合时间早于后两组(p＜0.05)。(2)A组、B组、C组创面挛缩的百分率分别为(39.45±4.40)％、(41.63±3.7)％、(51.81±2.67)％，A、B两组创面挛缩的百分率小于C组(P＜0.05)；A组创面挛缩的百分率小于B两，但无统计学差异(P＞0.05)。(3)A组、B组、C组创面愈合1周后表皮厚度分别为(1051.8±108.1)μm、(801.28±34.34)μm、(510.16±92.98)μm；A组表皮明显厚于B、C两组(P＜0.01)；B组表皮厚于C组(p＜0.05)(4)A组、B组、C组创面愈合后1周皮肤的最大中断拉力分别为(13.87±0.38)N、(11.86±0.57)N、(7.37±0.82)N；A组中断拉力大于后两组(P＜0.05及0.01)；B组大于C组(P＜0.01)。三组皮肤拉断时所延伸的长度分别为(12.71±1.81)mm、(11.71±1.23)mm、(5.69±0.61)mm，A、B两组延伸的长度大于C组(P＜0.01)；A、B两组无统计学差异(P＞0.05)。(5)A组创面愈合后第1、2周表皮下及真皮层PGP9.5荧光密度高于B组、C组(p＜0.01)；B组第2周真皮层和第4周表皮下PGP9.5荧光密度高于C组。(6)创面愈合后第8周，A组新生上皮有少量的短小的钉突形成；其中一个创面的真皮浅层(靠近表皮下)发现有汗腺和毛囊样结构的形成。其它两组均无上皮钉突和汗腺、毛囊样结构的形成。[结论]真皮再生模板提高了创面的愈合质量，促进了皮肤末梢神经纤维的修复，有诱导皮肤附件再生的可能。