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背景及目的:膀胱癌(BC,Bladdercancer)是泌尿外科常见的恶性肿瘤之一,是人类第9位最常见的恶性肿瘤及第13位最常见的肿瘤死亡原因,在世界范围内给社会造成很大的经济负担,严重影响着全面健康水平和生活质量。根据世界卫生组织(WHO,World Health Organization)的资料,在不久的将来膀胱癌的患病人数和死亡率将翻倍。虽然以顺铂为基础的化疗在过去数十年进展缓慢,但是通过二代测序技术,广泛分析膀胱癌分子改变,已经引领了膀胱癌治疗的新方向。另外基于膀胱癌的分子改变进行特异性的分类,可能更好的实现对膀胱癌患者的复发和预后进行预测,及以生物学标志物改变为依据的个性化治疗。要对膀咣癌患者实现精准治疗,必须考虑到每个患者特异性的发病机制和生物学改变;膀胱癌的分子改变可以发生在多种水平,包括基因组、表观遗传组、转录组、蛋白质组、脂质组和代谢组等。其中基因组的改变研究较为深入,很多已经应用于临床,包括以分子改变为基础的肿瘤分型和分期,监测患者体液和血液中突变基因的表达物等,来诊断和预测患者的预后。WTAP是一种核蛋白,定位于核质中,作为一种高度保守的分子,在正常生理过程和肿瘤的发生中都发挥着重要功能。比如对细胞周期的调节、RNA选择性剪切、m6A甲基化修饰、X-染色体的失活、眼的发育,及调节细胞休眠和增殖等。在血管平滑肌细胞WTAP能够调控细胞周期,抑制细胞的增殖而促进细胞凋亡;但它在其它类型的肿瘤中却发挥着癌基因的作用,包括肾癌、胆管癌、急性白血病、恶性胶质瘤、胰腺导管腺癌及肾癌等。目前为止,WTAP在膀胱癌中的作用及对膀胱癌细胞功能的影响还不是很清楚。本文旨在通过比较膀胱癌组织和正常膀胱粘膜组织中WTAP在不同水平的表达差异,包括 mRNA 水平(qRT-PCR,Quantitative Real-Time PCR)、蛋白水平(IHC,immunohistochemistry;Western blot);并且通过 log-rank 检验比较WTAP表达阳性和阴性患者的生存曲线,检测其对膀胱癌患者预后的影响;为了进一步揭示其对膀胱癌细胞功能的影响,通过体外实验,检测WTAP mRNA在膀胱癌细胞(T24和5637)及正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)的表达,结果显示在膀胱癌细胞中,它的表达量明显升高;最后通过在两种膀胱癌细胞转染WTAP过表达质粒,观察其过表达对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。实验材料和方法:1.病人及样本:62个膀胱移行细胞癌患者的膀胱肿瘤组织样本作为膀胱癌组,男性48人,女性14人,平均年龄57±19;20个正常的膀胱粘膜作为对照组,男性14人,女性6人,平均年龄52±13。2.组织样本的H&E(Hematoxylin-eosin)组织病理染色:膀胱肿瘤组织和正常的膀胱粘膜组织石蜡包埋,制成5μm厚的切片,然后按照常规方法进行H&E染色,镜下观察组织的结构和细胞核进行组织病理学分析。3.免疫组化(IHC,Immunohistochemistry)检测膀胱肿瘤组织和正常的膀胱粘膜中WTAP蛋白的表达部位及两组之间蛋白表达量的差异。4.qRT-PCR检测膀胱癌组织和细胞系中的WTAPmRNA表达水平,上下游引物分别为 5’-3’ CAACCTCTTTAGCCAAACAAGAA 和 3’-5’ ATTCCTGAGTGCAACAGC,GAPDH作为内参。5.蛋白印迹法(Westernblot)测量膀胱组织中WTAP蛋白表达,所用抗体包括WTAP单克隆抗体,GAPDH单克隆抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。6.Kaplan-Meier法绘制WTAP表达阳性和阴性患者的生存曲线,log-rank检验比较两组患者术后生存期的差异。7.细胞培养及转染:正常膀胱上皮细胞株(SV-HUC-1)和T24和5637人膀胱癌细胞,培养于基础培养基加10%胎牛血清(FBS,Fetal bovine serum)的培养基中。细胞培养环境为37℃,含有5%C02的培养箱。构建WTAP过表达的慢病毒质粒,5×103细胞/孔接种于96孔板,24h后(融合50%)进行转染。8.肿瘤细胞增殖和凋亡检测:转染后48h检测转染效率(qRT-PCR);0,24,48,72h检测细胞的增殖能力(MTT,3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-DiphenyltetrazoliumBromide),72h 后提取细胞蛋 白检测 Caspase-3 的表达(ELISA,Enzyme linked immunosorbent assay),评估细胞凋亡情况。9.统计学分析,数据以均数±标准差表示,P<0.05为差异有统计学意义,所有P值设为双尾,统计软件使用Mac SPSS 24。实验结果:1.H&E组织病理结果:在膀胱癌患者的组织H&E染色中出现明显的组织结构的破坏,细胞异型性明显,核分裂像较多,核大小不一,染色深,而正常对照组的膀胱粘膜结构完整。2.免疫组化结果(IHC):组织切片经WTAP特异性抗体染色后,产生棕黄色和褐色细胞核。提示在BC患者和正常膀胱粘膜的表达主要位于细胞核,且在BC组患者的表达量明显高于正常对照组(P<0.01)。3.qRT-PCR结果:在BC患者的膀胱肿瘤组织中,WTAP的mRNA表达量明显高于正常膀胱组织(P<0.05)。同样的,和正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1细胞相比,在两组膀胱癌细胞系(T24和5637)WTAP的表达量也出现明显升高(P<0.01)。4.Western blot结果:检测发现和正常对照组相比,WTAP的表达量在BC患者的膀胱组织中明显升高(P<0.01)。5.通过生存曲线及log-rank比较结果发现,在WTAP表达阴性的BC患者,其术后生存期和预后明显好于表达阳性的患者(P<0.05)。6.肿瘤细胞系(T24和5637)转染WTAP过表达质粒后,和转染空载体(NC,negative control)相比,细胞的增殖能力不断增强,凋亡减少(P<0.01)。结论:WTAP在膀胱癌组织和膀胱癌细胞系的表达量明显增加,而其在正常膀胱组织的表达量减少,和术后生存期及生存质量有关,提示其可能在膀胱癌发病过程中参与肿瘤细胞对机体的影响;在对T24及5637两种肿瘤细胞系进行WTAP过表达质粒转染后发现,它能够明显促进细胞的增殖而抑制凋亡。这些结果说明WTAP也许可以作为膀胱癌诊断和预测预后的有效生物学标志物,并且可以作为此类患者分子治疗的有效靶基因,为实现膀胱癌以分子改变为基础的分类提供理论依据。当然鉴于实验标本的数量限制、观察指标和机制探讨的局限性,这些结果转化于临床运用还需要更深入的基础实验和多中心、大样本的临床试验来支撑。