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目的:对云南兰坪地区带绦虫(LP株)进行种类鉴定;寻找操作简便、经济和准确的带绦虫种类鉴定方法。
方法:(1)形态学鉴定:采用盐酸卡红和孔雀绿染色,选择7株LP株带绦虫成虫的头节、成节和妊娠节片,并选取传统的猪带绦虫和牛带绦虫为对照,对LP株的种类进行初步的形态学鉴定;(2)rDNA—ITS限制性酶切片段长度多态性分析方法:选取妊娠节片,抽提基因组DNA,PCR扩增rDNA—ITS片段,用限制性内切酶DdeⅠ对扩增片段进行酶切分析,并与贵州都匀株(DY株)、牛带绦虫从江株(CJ株)及猪带绦虫大理株(DLZD株)对照;(3)rDNA—ITS1序列克隆测序方法:随机选取一LP株的基因组DNA,进行rDNA—ITS1 PCR扩增、克隆和测序,并与Genbank中已知DY株、CJ株和ZD株以及云南大理株(DL株)的rDNA—ITS1序列进行同源性比较,构建系统发育树状图。
结果:(1)由形态学析可知,7株LP株头节近方形,有4个吸盘,无顶突和小钩,成节卵巢分两叶,孕节子宫分支排列大致对称整齐,每侧分支数约15~30支,根部具有分支,支端有分叉,形态介于传统牛带绦虫和猪带绦虫间,与报道的亚洲带绦虫相似;(2)不同来源带绦虫株rDNA—ITS片段的PCR产物经限制性内切酶DdeⅠ酶切后,显示LP株与DY株的RFLP图谱一致,与DLZD株和CJ株均显著不同;(3)不同来源带绦虫株rDNA—ITS1片段测序结果经同源性分析表明,LP株、DY株、DL株、TW株与CJ株同源性为98%,五株带绦虫与ZD株同源性为92%,其中TW株、DY株和DL株同源性为99%;构建系统发育树状图后,DY株、DL株、TW株和LP株依次归类,再和CJ株归类,最后与ZD株归类。
结论:(1)云南兰坪地区带绦虫(LP株)为亚洲带绦虫;(2)4%孔雀绿水溶液染色为一种孔雀绿染色改良方法,适于绦虫妊娠节片染色;(3)PCR—RFLP方法经济、准确,能够对不同种类的带绦虫进行鉴别,适于带绦虫的分子流行病学调查。