NO是具多种功能的生物活性分子，也是造血祖细胞生长分化不可缺少的调节因子。NO通过调节红系和粒系集落形成的比例，从而影响造血干/祖细胞的生长分化。越来越多的证据表明许多造血系统疾病与NO有关。γ-射线和苯及衍生物促进骨髓细胞iNOS表达。再障患者中高表达的IFN-γ和TNF-β能促进CD34⁺细胞的iNOS表达，导致CD34⁺细胞凋亡数明显高于正常人。NOS抑制剂L-单甲基-精氨酸（L-NMMA）不仅能够逆转这种作用，而且能够抑制IFN-γ和TNF-β诱导的细胞凋亡。并且，NO能够引起P53基因突变，使DNA修复能力下降，促使造血干细胞过早地调亡。NO不仅能够抑制正常的造血细胞而且参与了某些诱导分化剂对恶性造血细胞的诱导。NaF、维甲酸（RA）和维生素D₃抑制恶性造血细胞时，细胞iNOS表达增高。iNOS的抑制剂能够阻断其作用，可见NO介导了正常和非正常造血细胞的损伤。为了更能说明NO可能是其他因素引起造血系统疾病发生、发展、转归的直接作用因子。本课题采用体外培养法观察NO直接作用于正常小鼠造血细胞和人类淋巴瘤细胞HL-60细胞株后各项指标的变化。为NO释放剂应用于造血系统疾病的临床治疗提供理论依据。亚硝基铁氰化钠（SNP）能在溶液中自发释放NO，通过检测溶液中NO₂^-证明SNP大约在两小时左右释放完全。因此在本次实验中采取SNP作为NO释放剂。（一）琼脂半固体法检测不同浓度SNP对粒单系克隆形成单位 （Colony Forming Unit-Granulomacrophage CFU-GM）、红 系克隆形成单位（Colony Forming Unit-Erythrocyte CFU-E） 的抑制作用。NO对造血细胞的损伤涉及到细胞增殖分化 能力的降低和细胞死亡数的增多。造血祖细胞是一类由造 血干细胞分化而来的，在特异性刺激因子的作用下，在半 固体培养基上能形成显微镜观察到的集落。计数集落数可 表明造血祖细胞的数目和其分化能力。将正常小鼠骨髓细 胞采用淋巴细胞分离液分离所得富含造血干/祖细胞的单个 浙江大学硕士论文 核细胞，分别用 CFU－GM和 CFUE培养液调整细胞数为 l．OX 10‘个／mL，力入不同浓度的 SNP，在 24了板上培养， 第 7、10、14天计数克隆数。结果表明，SNP能在体外抑 制正常造血干／祖细胞的克隆形成能力，并成剂量依赖性什 检验P＜0．05)。但SNP在低浓度时（0．smmol几）结果无 统计意义o＞0．05人 （二）流式细胞仪检测SNP对HL－60细胞周期的影响。①不同 浓度的SNP与HL－60细胞培养24’J’时②Zmmol／L SNP作用 0、8、16、24h。离心收集细胞，70％冷乙醇固定 24 ’J’ 时，加 DNA刀repkit中染色，流式细胞仪检测。在本次实 验中，由于凋亡细胞数随着SNP浓度的提高或者作用时间 的延长逐渐增加，使处于G。／G；期细胞、S期、G。／M期的 细胞数都绝对下降，但是在三者相对比较时，G。／G；的细 胞数成上升趋势，而S期、G。／M成下降趋势。也可以说 SNP作用于HL60细胞后使得G。／G；期细胞增多，而S期、 G／M期细胞减少。并成剂量、时间依赖性。表明NO能抑 制HL－60细胞的DNA复制及有丝分裂来抑制HL－60细胞 生长。 （三）SNP诱导 HL60细胞凋亡检测。细胞凋亡过程中，激活 内源性DNA内切酶，在核小体单位之间被随机切断，形 成 180习 核小体 DNA多聚体。在凝胶电泳中表现为 梯型DNA图谱（DNA Ladder）。DNA双链断裂会生成一 系列 DNA 3’0H末端，可被脱氧核糖核苦酸末端转移酶 （TdT）的标记。由于凋亡细胞 DNA裂解而大量丢失，可 在流失细胞仪检测时出现一个亚二倍体峰，又称细胞凋亡 峰(AP人 根据AP峰可计算细胞凋亡的百分率。在细胞 凋亡过成中，细胞的形态也发生一定的改变，如核染色质 凝集、核碎裂、细胞质膜有表面突出，而呈发芽或发泡现 象。胞质突起脱落而导致凋亡小体形成。本次实验中，SNP 处理 HL七0细胞 24小时后，DNA电泳出现典型的 180hp 倍数的梯状条带，而对照组则无DNA梯状条带，呈基因 3 浙江大学硕士论文 组条带。而在TUNERL法中，显微镜观察到棕色的细胞为 凋亡细胞，可看到核固缩和核碎裂，并可见到棕色的凋亡 小体。0、0．5、l、Zmmol／L SNP作用 24h后 H L－60凋亡细 胞率分别为 1％，10％，40％，80％。透射电镜中观察到随 着SNP作用时间的延长，细胞形态变化愈加明显，核固缩， 核边聚，核碎裂，染色质凝聚，并可见到典型的半月型核。 SNP可影响细胞周期，诱导出现细胞凋亡群体，亚h倍体 ?