刺五加是五加科、五加属植物的干燥根、根茎,具有健骨强心、益脾补肾、益寿延年等功效,主要用于脾肺气虚,食欲不振,肺肾两虚,久咳虚喘,肾虚腰膝酸痛,心脾不足,失眠多梦等症,然而根、根茎等药用部位过度利用,导致刺五加野生资源、人工种植资源遭到破坏;刺五加果实作为繁殖器官具有大量营养成分,采摘后又不影响刺五加植株生长,对刺五加果实化学成分及入血成分进行分析、检测其对小鼠免疫功能的调节作用,将为深入开发刺五加资源提供研究基础,有利于刺五加资源的可持续发展。目的:分析刺五加果实的化学成分和口服给药后的体内直接作用物质,并评价其增强免疫力保健功能。方法:1刺五加果实中化学成分的分析:取刺五加干燥果实,以30%乙醉作为提取溶剂,加热回流提取2次(2h/次)经浓缩,制成冻干粉后,再用50%甲醇作为提取溶液,超声提取10min,离心取上清液为供试品溶液,用UPLC-HD/MS技术分析方法对刺五加果实供试品溶液进行分离、分析,利用高清质谱检测的精确质量核质比计算出可能的元素组成,根据色谱峰的二级离子碎片解析其可能的化学结构,比对相关文献,确定色谱峰对应的化学成分。2刺五加果实血中移行成分分析:将制备好的刺五加果实冻干粉用蒸馏水配置成0.2g/ml的溶液,取禁食12h(自由饮水)的Wistar大鼠,按照10mL/kg灌胃给予五加果实冻干粉灌胃液,给药60min后,麻醉取肝门静脉血,用固相萃取的方法分离、净化和富集含药血清样品,以建立好的UPLC-HD/MS分析方法对血清样品进行分离、分析并采用直观比较、多变量数据分析、及Metabolynx软件进行数据分析,以获得刺五加果实入血成分。3刺五加果实免疫调节作用:根据《保健食品检验与评价技术规范》中增强免疫力功能的试验方法,采用清洁级昆明小鼠分别经口灌胃给药刺五加果水煎液12.5g/kg、25g/kg和50g/kg30天后,分别进行刺五加果实对小鼠细胞免疫、体液免疫、NK细胞免疫、单核巨嗜细胞免疫等免疫调节实验,检测小鼠胸腺指数、脾指数、足趾肿胀程度、Cona刺激脾细胞增殖程度、溶血空斑数、血清溶血素凝集程度、NK细胞杀伤能力、炭粒廓清指数等免疫学指标。结果:1本实验用采用已建立刺五加果实全成分分析方法,用液质联用技术在24min内完成数据采集,在负离子模式下表征了包括黄酮类,三萜皂苷类,木脂素类、有机酸类等104个化学成分,主要成分是:4-O-Galactopyranuronos yl-galactopyranuronate、Sucrose(蔗糖)、Melezitosc、3-Hydroxy-2-butany 16-O-[3,4-dihydroxy-4-(hydroxymethyl)tetrahydro-2-furanyl]-glucopyranosid、Proto catechuic acid-glucoside(原儿茶酸-葡萄糖苷)、Methyl5-({3,4-dihydroxy-4-(hydroxy me thy l)te tr ahy dro-2-furany l]-glucopy ranosy 1} oxy)-2-hydroxy benzo at e、caffeoylquinic.acid diglucoside(咖啡酰奎宁酸二糖苷)、isopropyl-apiofura nosyl-(l->6)-glucopyranoside、Buty 4/6-O-galactopyranosy 1-β-D-glucopyran oside、caffeoylquinic acid glucosid(咖啡酰奎宁酸葡萄糖苷)、3-Carboxy-4-h ydroxy-phenoxy glucoside、6-O-(4-Hydroxy-3-methoxybenzoyl)-glucopyrano se、Scopolin(东莨菪苷)、Protocatechuic acid、caffeoylquinic.acid glucoside、Neochlorogenic acid(新绿源酸)、Ferulyl quinic acid glucoside(阿魏酸奎宁酸葡萄糖苷)、3,4-Dihydroxy ally 1 benzene、4-O-[rhamnopy ranosyl-(1>6)]-gluc op yranoside、1-Caffeoyl glucose、4-Fo rmy l-2,6-di methoxy phenyl β-D-glucopyra noside、caffeoylquinic acid(咖啡酰奎宁酸)、Magnoliosid(香草 酸)、10-Deox ygeniposidic acid、1-O-sinapoyl-β-D-glucose/Methy 1-1-(β-D-glucopyranosy 1 ox y)-7-(hydroxy methyl)-1,7a-dihydrocyclopenta[c]pyran-4-carboxylat、trans-4,4’-Dihydroxy-3,3’-dimethoxystilbene、Chlorogenic acid、Caffeic acid、Syringin(紫丁香苷)、Sinapyl alcohlo、p-Coumaroyl quinic acid(对香豆醜奎尼酸)、{(1 R,2R)-2-[(2Z)-5-(β-D-glucopy ranosy 1 oxy)pent-2-en-1-yl]-3-oxocyclopentyl}acetic acid、Benzyl 6-O-(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)-p-D-glucopyranoside、Dicaffeoylquinic acid glucoside、(2E)-3-[4-({(1S,2S)-1-[4-(β-D-Glucopyranos yloxy)-3-methoxyphenyl]-1,3-dihy droxy-2-propanyl} oxy)-3-methoxy phenyl]acr ylicacid、2Hydroxy-5-isopropenyl-2-methylcyclohexyl、Astilbin(落新妇苷)、Methyl(1 R,4aS,6S,7R,7aS)-6-({[(2S,3 R,4S)-2-(β-D-glucopy ranosy loxy)-4-(2-hy droxy ethyl)-3-viny l-3,4-dihydro-2H-py ran-5-yl]carbonyl} oxy)-1-hydroxy-7-met hyl-1,4a,5,6,7,7a-hexahydrocyclopenta[c]pyran-4-carboxylat、6-O-[3,4-dihydro xy-4-(hydroxymethyl)tetrahydro-2-furanyl]-β-D-glucopyranosid、4-{(1 S,3aR,4 S,6aR)-4-[4-(β-D-Glucopyranosyloxy)-3-methoxyphenyl]tetrahydro-1 H,3H-furo[3,4-c]furan-1-yl}-2-methoxyphenyl β-D-glucopyranoside、Orientin/(红草素)Hyperin(金丝桃苷)、4-{4-[4-(β-D-Glucopyranosyloxy)-3,5-dimethoxyphenyl]te trahydro-1 H,3H-furo[3,4-c]furan-1-yl}-2-methoxyphenyl、Eleutheroside E(刺五加苷E)、Hesperetin 7-O-glucosid(橙皮苷-7-o-葡萄糖苷)、4-(1,3-Dihydroxy-2-{4-[(1 E)-3-hydroxy-1-propen-1-yl]-2-methoxyphenoxy} propyl)-2-methoxyph enyl hexopyranoside、Niduloic acid、Quercetin-3-arabinoglucoside、Rutin(芦丁)、4-{(1 S,2R)-1,3-Dihydroxy-2-[4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenoxy]pro pyl}-2-methoxyphenyl β-D-glucopyranoside、3-O-caffeoyl-Feruloy lquinicAcid(3-O-咖啡酰-阿魏酰葡萄糖苷)、(1 S,2S)-3-Hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyp henyl)-2-[4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenoxy]propyl β-D-glucopyranosid e、Methyl2-O-β-D-glucosyloxy-4-methoxybenzenepropanoate、matairesinol、7-(Acetoxymethyl)-4-[(β-D-glucopyranosyloxy)methyl]-6,7-dihydroxy-1,4 a,5,6,7,7a-hexahydrocyclopenta[c]pyran-1-yl 3-methylbutanoate、Medioresinol 4’-O-β-D-glucopyranoside、Azelaic acid、4-{[(3R,4R,5S)-5-(4-Hydroxy-3,5-dimetho xyphenyl)-4-(hydroxymethyl)tetrahydro-3-furanyl]methyl}-2,6-dimethoxypheny 1β-D-glucopyranosid、3,4-Dicaff-eoyl-quinic acid(3,4-二咖啡酰奎宁酸)、4-(1,3-Dihydroxy-2-{4-[(1 E)-3-hydroxy-1-propen-1-yl]-2,6-dim ethoxy ph enoxy} prop yl)-2-methoxyphenyl β-D-allopyranoside、3,5-Dicaffeoyl-quinic acid(3,5-二咖啡酰奎宁酸)、2-O-Caffeoyl arbutin、7-Hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphen yl)-3-(hydroxymethyl)-6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydro-2-naphthalenyl]methylβ-D-glucopyranoside、Quercitrin(槲皮苷)、1-Methoxyoxalyl-3,5-dicaffeoylquinic acid、(2E)-3-Phenyl-2-propen-1-yl-6-O-(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)-β-D-gl ucopyranoside、4-[4-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)tetrahydro-1H,3H-furo[3,4-c]furan-1-yl]-2-methoxyphenyl β-D-glucopyranoside、4,5-Dicaffeoyl-quinic ac id(4,5-二咖啡酰奎宁酸)、Secoisolariciresinol、804/804-dehydrotriferulic aci d、Acanthopanaxoside E(无梗五加苷 E)、Acanjaposide G/Acanjaposide H(刺五加苷G)、Trihydroxyoctadecanoic acid、trihydroxy-10(11)-octadecenoic aci d、28-Hydroxy-28-oxoolean-12-en-3-yl-3-O-xylopyranosyl-glucopyranosiduron ic acid、3-{[2,6-Dideoxy-3-O-methyl-ribo-hexopyranosyl-(1->4)-2,6-dideoxy-3-O-methyl-arabino-hexopyranosyl-(1->4)-2,6-dideoxy-3-O-methyl-β-D-arabino-hexopyranosyl-(1->4)-2,6-dideoxy-3-O-methyl-β-D-ribo-hexopy ranosy l-(1->4)-2,6-dideoxy-3-O-methyl-β-D-ribo-hexopyranosyl]oxy}-8,14,1 7-tri hydroxy-20-o xopregn-5-en-1 2-yl benzoate、α-HEDERIN(α-常春藤皂苷)、Hederagenin 3-O-arabinoside、3-O-β-D-Glucuronopyranosyl-gypsogenin-28-O-β-D-glucopyrano side、Silphioside G(罗盘草苷)、hederagenin-3-o-glucuro nopyraoside(常春藤皂苷元--3-o-葡萄吡喃糖苷)、Ciwujianoside E(刺五加苷 E)、3-{[2-O-(Lyxop yranosyl)-galactopyranosyl]oxy}olean-1 2-en-28-oic acid、Oleanoicacid-3-O-gl ucuronide(齐墩果酸-3-o-葡萄糖甘酸)、Eleutheroside K(五加苷 k)、1 3-Hydro xy-9,11-octadecadienoic acid、3-Hydroxyhexadecanoic acid 等化合物。2本实验采用已建立刺五加果实全成分分析方法,本实验利用液质联用的技术平台分析表征了 口服刺五加果实后的血清移行成分,采用直观比较、多变量数据分析、及Metabolynx软件进行数据分析,最后在刺五加果实给药大鼠血清中,共找出24个为原型成分,其成分为:Methy5-({3,4dihydroxy-4-(hydroxymethy l)tetrahy dro-2-furanyl-gluc opy ranosy l} oxy)-2-hy droxyb-enzoat e、6-O-(4-Hydroxy-3-methoxy-Benzoyl)-glucopyranose、Phenyl-2-O-(6-deoxy-α-L-galactopyranosyl)-β-D-galactopyranoside、(1 s,4aS,5R,7aS)-1-(β-D-glucopy ranosy loxy)-5-{[2(E)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-propenoy-L]oxy}-7-(methoxymeth yl)-1,4a,5,7a-tetrahydrocy cl open ta[c]pyr an-4-car boxy late、2-Hy-Droxy-5-isopr openyl-2-methylcyclohexyl-glucopyranoside、刺五加苷E、常春藤皂苷元3-O-阿拉伯糖苷、常春藤皂苷元-3-O-吡喃葡萄糖苷、芦丁、落新妇苷、金丝桃苷、3-O-咖啡酰阿魏酰奎宁、Niduolic acid、(2E)-3[4-({1S,2S)-1-[4-(β-D-Gl ucopyranos-yloxy)-3-methoxypenyl]-1,3-dihydroxy-2-propanyl}oxy)-3-methoxy penyl]acrylic aci、原儿茶酸、绿源酸、1-咖啡酰葡萄糖、木兰苷、10-Deoxy geniposidic acid、、咖啡酸、二咖啡酰奎宁酸葡萄糖苷、Benzyl6-O-pentopy ranosy lhexopyanoside。3(1)细胞免疫实验:低剂量刺五加果实提取液提高迟发型超敏反应程度,促使小鼠足趾肿胀,与对照组相比具有显著性差异(P<0.05);高剂量刺五加果实提取液提高了脾细胞增殖能力,与对照组相比具有极显著性差异(P<0.01);中剂量刺五加果实提取液提高了小鼠的胸腺指数,与对照组相比具有显著性差异(P<0.05);低剂量刺五加果实提取液提高了小鼠的脾脏指数,与对照组相比具有极显著性差异(P<0.0 1)。通过以上细胞免疫功能测评指标,验证了刺五加果实对小鼠细胞免疫的调节作用,是通过增加免疫器官重量、提高迟发型超敏反程度、促使淋巴细胞增殖能力增强完成的。(2)体液免疫实验:三个剂量刺五加果实提取液均可增加溶血空斑数,与对照组相比具有极显著性差异(P<0.01);中、高剂量刺五加果实提取液提升了小鼠血清溶血素水平,中剂量组对照组相比具有显著性差异(P<0.05)、高剂量组与对照组相比具有极显著性差异(P<0.01)。通过以上体液免疫功能测评指标,验证了刺五加果实对小鼠体液免疫的调节作用是通过增加抗体数量、提升血清溶血素水平完成的。(3)NK细胞免疫实验:低、高剂量刺五加果实提取液提高了小鼠NK细胞的活性,促使对淋巴瘤细胞的杀伤能力增强,低剂量组与与对照组相比具有极显著性差异(P<0.01)、高剂量组与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。通过以上NK细胞活性测评指标,验证了刺五加果实对小鼠NK细胞免疫调节作用是通过增强NK细胞活性强完成。(4)巨噬细胞免疫实验:三个剂量组刺五加果实提取液均不能提高小鼠巨嗜细胞的吞噬能力,说明刺五加果实对巨噬细胞不具有免疫调节作用。结论:本研究分析、鉴定了刺五加果实体外样品化学成分,及给予刺五加果实后血中移行成分,并验证刺五加果实对机体免疫功能的调节作用是通过增加免疫器官胸腺、脾脏重量;促进淋巴T细胞增殖,调节淋巴B细胞功能,提高NK细胞杀伤能力等环节实现,为刺五加果实药效物质基础的确立、药效物质作用质机制的研究、创新药物的开发利用奠定了基础,对刺五加资源的综合利用及可持续发展具有重要意义。