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目的：
暴发性肝衰竭(FHF)并发症多,病死率高,预后差,是严重危害人类健康的疾病.肝肾综合征(hepatorenalsyndrome,HRS)是肝硬化或其他严重肝病时发生的一种预后极差的严重并发症,以肾功能衰竭、血流动力学改变和内源性血管活性物质激活、肾动脉显著收缩导致肾小球滤过率降低为特征。那么暴发性肝衰竭大鼠肾小球毛细血管容积是否发生相应改变呢?我们应用D-氨基半乳糖(D-GaIN)联合脂多糖(LPS)构建暴发性肝衰竭(FHF)大鼠模型,为了排除血浆中其它血管活性物质对血管舒缩活性的干扰,本实验用FITC(荧光素——异硫氰酸酯)标记的菊粉,通过检测肾小球菊粉含量(GIS)前后变化的百分比,计算肾小球毛细血管容积的变化。
材料与方法：
1、材料：
选取SPF级别雄性SD大鼠,体重220±20g,实验前分笼饲养,室温23±3℃,每隔12h开灯照明,普通饲料,自由饮水,饲养一周后用于实验。
2、方法：
(1)构建暴发性肝衰竭(FHF)模型,根据既往研究结果,选择D-GalN400mg/kg、LPS32μg/kg的生理盐水溶液(2ml/kg)尾静脉注射为建模剂量,根据肝肾功能损害及肝细胞坏死情况,确定阻断时间点为建模后12h。
(2)分组,分为4组,即:生理盐水对照组(NS组);D-GalH/LPS联合给药组(G/L12h组):D-GalH单独给药组(G12h组);LPS单独给药组(L12h组),其中G/L组设置7只大鼠,其余各组均设置5只。
(3)测定各组血清丙氨酸氨基转移酶(ALT),尿素氮(BUN),肌酐(Cr),钾离子(K+),钠离子(Na+),氯离子(Cl-),肿瘤坏死因子α(TNFα)、内皮素-1(ET-1);肝组织常规HE染色,光镜下观察肝细胞坏死情况及组织结构是否发生改变。
(4)肝肾组织病理学检查,肝组织石蜡包埋固定后切片(4.0μm)常规HE染色,光镜下观察肝细胞坏死情况。电镜标本常规脱水包埋,半薄切片经甲苯胺蓝染色后光镜下固定,醋酸铀及柠檬酸铅双重染色后,在JEOUEM-1230型透射电镜下观察肾组织超微结构并拍照。
(5)筛网法迅速分离各组大鼠的肾小球,收集到1.5ml的EP管中,最后定容至1.0ml,用细胞计数板计数肾小球数目(计数方法:4000个肾小球应取浓缩液体量=1600/N×稀释倍数,其中N=计数板横槽上下肾小球数目之和/2),以400μlPBS(含1%BSA)重悬肾小球4000个,加入FITC标记的菊粉,避光,37℃水浴100g/min摇动30min,等分成二管,其中一管加内皮素,另一管不加内皮素,500g离心1Os,取20μl上清后,弃上清,吸净残余液体,向管底沉淀之肾小球团块中加500μl0.3%TritonX-100,重悬后溶解过夜,后应用荧光分光光度计分别检测每个样品上清及肾小球团块FITC标记菊粉的荧光值(FI),激发波长为488nm,发射波长为515nm,应用公式GIS(μl)=FI(肾小球)/FI(上清/20g1)×2000计算出GIS值,并计算每个肾小球收缩前后GIS变化的百分率。
(6)统计学处理:采用spss17.0软件分析,数据均值±标准差(-x±s)表示,采用单因素方差分析,并进行均数两两比较,P＜0.05具有统计学意义。
结果：
1、血清肝肾功能生物化学指标
G/L组ALT、BUN、Cr、TNF玖、ET-1均在给药后12h明显升高达峰值,与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05),并且在12h时间点G/L组上述五项指标分别与G组、L组相比较,均有显著性差异(P＜0.05),从客观上排除了D-GalN、LPS药物本身对上述五项指标的影响。
2、肝肾组织病理学检查结果
肉眼观察D-GalH/LPS联合给药12h后肝脏呈酱紫色,充血肿胀,弥漫出血点,切面有暗红色淤血或黄色乳糜状坏死物质溢出。光镜下肝细胞大片坏死,没有肝细胞再生,纤维间隔塌陷,充填大量红细胞。电镜下观察。肾小球、近曲小管、远曲小管结构均正常,提示造模成功。
3、NS组、G12h组、L12h组、G/L12h组肾小球菊粉含量(GIS)
结果：
G/L12h组GIS与NS组比较明显降低,有显著性差异(P=0.000),G/L12h组GIS与G12h组、L12h组相比,均有显著性差异(P值均为0.000),差异具有统计学意义。
结论：
1、D-GalH/LPS联合打击SD大鼠,成功构建FHF动物模型。
2、D-GalH/LPS联合打击后12h肝肾功能损害及肝细胞坏死最严重,是我们选择的阻断时间点。
3、暴发性肝衰竭大鼠肾小球毛细血管容积明显降低。