油包水液滴作为一种新型微反应器，具有体积小、封装独立、高通量、高灵敏度等特点，已广泛应用于单分子聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)、酶活性检测、蛋白质结晶研究、基因突变检测等领域。但是，传统的液滴技术仍然存在一系列缺陷:大小不均一、有效单分子液滴产率低、反应效率低、反应后难保持产物的单克隆性、甚至需搭建复杂的在线分析检测系统等。本课题组将低凝胶点琼脂糖引入液滴体系，成功搭建了一个面向单分子琼脂糖液滴微流控的分析检测平台。低凝胶点琼脂糖的优势在于:高温时呈液态能作为反应液以提高反应效率及有效单分子液滴产率;低温时凝固能作为反应产物的载体以保持产物的单克隆性，且可用于后续的各种分析如荧光显微镜、流式细胞仪分析等，无需搭建复杂的在线分析检测系统。之前课题组实现了琼脂糖液滴的单拷贝DNA、RNA及单细胞分析，并将其应用于稀有致病菌检测、单细胞基因表达分析、高通量核酸适体筛选等方面。本论文旨在发展适用于琼脂糖体系的信号放大方法，进一步拓宽琼脂糖液滴在稀有致病基因突变以及痕量疾病蛋白标志物的单分子水平检测方面的应用。　　本论文包含以下研究内容:　　第二章:设计制作了十字交叉型流聚焦玻璃微流控芯片，将低凝胶点琼脂糖溶液作为水相通入芯片，于十字交叉处在油相的剪切力作用下生成大小均一、可调的油包琼脂糖液滴。实验表明，琼脂糖液滴具有良好的稳定性，在高温下不会发生融和、破裂等现象，且经冷凝、除油处理后，琼脂糖凝胶微球仍能保持大小均一、形态完整。　　第三章:建立了面向琼脂糖液滴微流控单分子水平单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)检测的连接介导PCR(Ligation-MediatedPCR，LMPCR)信号放大方法。将高特异性的寡核苷酸连接法和高灵敏度的PCR放大方法相结合用于高选择性SNP检测。首先，验证了LMPCR法在水相、琼脂糖相及油包琼脂糖液滴中反应的可行性，以及所设计的连接探针对野生型、突变型模板的特异性，即SNP检测的可行性。其次，对单分散油包琼脂糖液滴中单分子LMPCR放大的可行性进行了探索。将LMPCR正向引物通过希夫碱反应共价偶联到琼脂糖大分子上，从而使扩增产物固定在琼脂糖凝胶微球内部。利用荧光标记反向引物对扩增产物进行荧光显微拍照分析和流式细胞仪表征。实验表明，利用LMPCR放大方法结合琼脂糖液滴微流控技术可以达到单分子放大检测目标DNA分子的目的，琼脂糖液滴微流控技术可以用于稀有致病突变基因的单分子SNP检测。　　第四章:探索了面向琼脂糖液滴微流控单分子酶联免疫吸附实验(Enzyme-linkedImmuno-sorbentassay,ELISA)的酶放大方法在琼脂糖体系中的可行性，为实现琼脂糖液滴中痕量疾病蛋白标志物的高通量单分子检测奠定基础。实验验证了2％的琼脂糖溶液适用于β-半乳糖苷酶反应，其粘度对酶反应效率几乎没有影响。证明了酶反应产物荧光素分子不会扩散到液滴外层的油相，以保持实验结果的单克隆性。2％琼脂糖溶液中实验结果表明，在模拟液滴直径为10μm及以下时，单分子浓度酶反应的产物荧光强度可达荧光分光光度计检测水平，反应信背比为7倍左右。而相同量产物在小体积液滴环境中的相对浓度更高，更加有利于单分子酶反应放大检测，当液滴直径小于10μm时，油包琼脂糖液滴中痕量疾病蛋白标志物的检测可以达到单分子水平。　　本文建立了两种信号放大方法，LMPCR及ELISA法用于琼脂糖液滴中的单分子检测。这两种方法与琼脂糖液滴微流控技术结合将在稀有致病突变基因检测、痕量疾病蛋白标志物分析、肿瘤细胞早期诊断、单分子酶活性研究等现代生物分析领域具有广泛的应用前景。