论文部分内容阅读
一、目的: 阐明去卵巢大鼠与FAK/Src/p130Cas系统及下游信号关键因子的关系，从破骨细胞的分化和功能调节的角度揭示青娥方防治绝经后骨质疏松症的作用机制。 二、方法: 1在体实验 1.1动物造模、分组、干预、取材:3月龄SPF级雌性SD大鼠120只，随机分成4组:假手术组、单纯去卵巢组、去卵巢+骨疏康组和去卵巢+青娥方组，各30只。除假手术组外，其余3组行双侧卵巢结扎切除术。假手术组除未行卵巢结扎切除外，其余步骤同其余3组。术后3天开始灌胃，去卵巢+骨疏康组给予骨疏康颗粒1.8g·kg-1·d-1，去卵巢+青娥方组给予青娥方浸膏0.62g·kg-1·d-1，假手术组和单纯去卵巢组以生理盐水灌胃。用药后4周、8周、12周每组分别处死10只，取血清、股骨、胫骨和腰椎骨备用。 1.2指标检测:ELISA法检测血清E2、TRAP、BALP含量和尿DPD/Cr含量以观察骨代谢的变化;双能X射线骨密度仪检测右股骨颈、右胫骨上段以及腰4-6椎体密度;随后应用三点弯曲法行右股骨生物力学检测，压缩法行腰4椎体生物力学检测;左股骨颈、左胫骨上段和腰3椎体制作石蜡切片，MASSON染色后行形态学分析骨小梁面积百分比;腰1椎体提取组织RNA，实时荧光定量PCR法检测FAK/Src/p130Cas系统及下游信号通路关键因子Crk、C3G和RAS的mRNA表达。腰2椎体提取组织蛋白，Western Blot法检测FAK/Src/p130Cas系统及下游信号关键因子Crk、C3G和RAS蛋白的表达。 2体外实验 2.1含药血清制备:取3月龄SPF级雌性SD大鼠60只，分为青娥方组和空白组，各30只，青娥方组给予青娥方浸膏0.62g·kg-1·d-1，空白组给予生理盐水2mL·d-1，连续灌胃7天，于最后一次灌胃后1h腹主动脉无菌取血，凝固后离心取血清备用。 2.2细胞培养和指标检测:破骨细胞前体细胞株RAW264.7分为空白血清组和含药血清组。空白组和青娥方组在50ng/mL RANKL+30ng/mL MCSF诱导下，用梯度浓度含药血清干预RAW264.7细胞分化成破骨细胞，以选择最佳血清浓度。空白组和青娥方组分别加入最佳浓度空白血清和青娥方含药血清培养:①干预2、4、6天，观察RAW264.7细胞的存活率;②干预12、24小时后，提取细胞上清液，应用ELISA法检测PGE2、TNF-α和IL-6含量。RAW264.7细胞接种后分4组:空白组、青娥方组、空白+FAK抑制剂组和青娥+FAK抑制剂组，分别加入最佳浓度空白血清和青娥方含药血清以及FAK抑制剂，在50ng/mL RANKL+30ng/mL MCSF诱导下:①干预2、4、6天，观察RAW264.7细胞分化破骨细胞;②干预12、24小时后，提取细胞RNA和蛋白，实时荧光定量PCR法和Western Blot法检测FAK/Src/p130Cas系统及下游信号关键因子Crk、C3G和RAS的mRNA表达及蛋白的表达。 三、结果: 1、用药后4、8、12周，单纯去卵巢组与假手术对照组相比，骨小梁纤细、断裂、不完整，骨密度和骨生物力学指标持续下降。血清E2含量持续下降，血清TRAP、BALP含量和尿DPD/Cr含量等骨代谢指标均明显升高，呈动态变化。用药后4周，FAK、p130Cas表达缓慢升高，第8周达到最高峰，12周有所回落。用药后4周，SRC、CRK、C3G表达急剧升高，第8、12周逐渐降低，但仍比同期假手术期高。RAS表达呈现升高、降低、升高的“V”形变化。 2、青娥方干预可明显增加去卵巢大鼠的骨密度，提高骨生物力学性能，逆转去卵巢导致的骨代谢指标变化;降低去卵巢后骨组织FAK、SRC、p130Cas、CRK、C3G和RAS的表达。 3、RANKL+MCSF刺激增加破骨前体细胞FAK/SRC/ p130Cas及其下游信号分子CRK、C3G和RAS的RNA和蛋白表达，从而诱导破骨细胞分化。青娥方含药血清能抑制破骨前体细胞的存活、分化，降低FAK/SRC/ p130Cas及其下游信号分子的RNA和蛋白表达。 四、结论: 1、去卵巢大鼠术后早期FAK/SRC/p130Cas及下游分子即可出现高表达，随时间推移呈现进一步升高或降低的不同趋势，但均高于假手术组。其变化时间早于有意义的BMD下降或骨代谢指标，可作为绝经后骨代谢预测和防治的参考指标。 2、青娥方能明显抑制骨组织FAK/SRC/p130Cas及下游分子的高表达，改善去卵巢后骨代谢水平，从而达到防治绝经后骨质疏松的目的。 3、青娥方抑制破骨细胞前体细胞的存活、分化，下调炎症因子PEG2、TNF-α和IL-6分泌，抑制骨组织FAK/SRC/p130Cas及下游分子的高表达，改善去卵巢后骨代谢水平，从而达到防治绝经后骨质疏松的目的。