论文部分内容阅读
肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，其死亡率在恶性肿瘤中仅次于胃、食道而居第三位。在我国每年约有11万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的45%。研究表明原发性肝癌的预后比较差的主要原因是缺乏特异的早期诊断指标和治疗手段，而研究肝癌的发病机理有助于提高肝癌的早期诊断率，指导肝癌的正确治疗。Tg737基因是近年发现的一种肝癌抑癌基因，最初进行研究时发现该基因与遗传性多囊肾病（autosomal recessive polycystic kidney disease, ARPKD）orpk鼠突变模型研究中的目的基因相同。但到目前为止，对于Tg737基因在肝癌发病过程中的如何发挥作用并不十分清楚。因此，进一步揭示Tg737基因的生物学功能，丰富和发展肝癌发生发展理论，为肝癌早期诊断及治疗提供依据有着十分重要的意义。本研究共分三个部分：第一部分Tg737基因在肝癌中的表达及相关性研究目的观察Tg737基因在肝癌组织和细胞中的表达，并分析其与肝癌的相关性。方法采用RT-PCR和Western blot方法检测人肝癌组织和肝癌细胞系中Tg737 mRNA和蛋白的表达，并通过统计学方法对表达情况与肝癌的相关性进行分析。结果人正常肝细胞系HL-7702中Tg737的mRNA表达和蛋白表达水平均高于肝癌细胞HepG2和MHCC97。65例肝癌组织标本中有30例Tg737mRNA表达呈阳性，且表达水平较相应癌旁组织低；34例检测出Tg737蛋白的阳性表达。而65例癌旁组织中有61例检测出Tg737 mRNA的阳性表达；59例Tg737蛋白表达呈阳性。18例早期（Ⅰ-Ⅱ）肝癌组织中15例Tg737蛋白表达呈阳性，47例中晚期（Ⅲ-Ⅳ）肝癌中19例呈阳性，二者比较有统计学意义。结论Tg737基因作为肝癌的抑癌基因，其表达下调可能是肝癌发生、发展过程中的重要因素，检测Tg737基因的表达可能作为判断肝癌分期的参考指标。第二部分Tg737基因对肝癌细胞活性的影响目的构建Tg737基因的真核表达载体，并将其导入肝癌细胞中，观察该基因对人肝癌细胞增殖活性的影响。方法以临床获取的人正常肝组织的mRNA为模板，通过RT-PCR方法获得Tg737基因全长序列，将其克隆至pEGFP-C1载体，进行序列、酶切鉴定。将HepG2细胞随机分为三组：HepG2-Tg737组（pEGFP-Tg737转染组）、HepG2-vect组（空质粒转染组）和HepG2组（空白对照组），利用脂质体转染法将重组质粒转染至肝癌细胞系HepG2中；通过Real-time PCR及Western blot方法明确转染48h后，各组细胞中Tg737的表达情况，并通过流式细胞仪和MTT比色法观察其对细胞周期和活性的影响。结果我们成功构建了真核表达载体pEGFP-Tg737，将其转染至肝癌细胞系HepG248h后，HepG2-Tg737组细胞中Tg737mRNA和蛋白的表达水平均明显高于HepG2-vect组和HepG2组。与其它两组相比，HepG2-Tg737组细胞生长明显受到抑制，G1期细胞比例高于HepG2-vect组和HepG2组，S期细胞比例明显较低。结论Tg737基因能够过表达于肝癌细胞HepG2中，并可抑制该细胞的增殖能力。第三部分肝癌中Tg737基因杂合性缺失的研究目的检测肝癌中Tg737基因的杂合性缺失情况，并分析微卫星位点杂合性缺失与临床病理特征的关系。方法应用聚合酶链反应-单链构象多态性技术（PCR-SSCP）检测Tg737基因的五个微卫星位点(RH65721、RH118612、SHGC-57879、STS-U20362和G64212)杂合性缺失情况，并通过统计学方法对缺失情况与肝癌临床病理参数的相关性进行分析。结果Tg737基因的五个微卫星位点RH65721、RH118612、SHGC-57879、STS-U20362和G64212的LOH发生频率分别为61.54% (32/65)、52.31%(34/65)、65.45%(36/65)、58.33%(28/65)、74.47%(35/65)；五个位点之间的LOH发生率差异无统计学意义（P>0.05）。微卫星位点SHGC-57879和G64212的LOH发生率与肝癌的转移及TNM分期相关（P<0.05）。结论Tg737基因在肝癌中存在较大比例的杂合性缺失，其微卫星位点表现出较高的不稳定性，影响基因的表达。通过以上的研究，初步证实了Tg737基因在肝癌发生的过程中发挥着抑癌基因的作用，对肝癌细胞的增殖有明显的抑制作用。而且Tg737基因在肝癌中存在杂合性缺失，其微卫星位点表现出较高的不稳定性，进而影响基因的表达。因此，Tg737基因有可能作为肝癌的基因治疗靶点，为肝癌的基因治疗提供新思路。