本文以我国首株分离到的人H5N1亚型流感病毒的血凝素(HA)基因为模板，构建了针对人禽流感的DNA疫苗。选用的真核表达载体pStar具有一个内部核糖体进入位点(IRES)，在其上下游分别存在一个多克隆位点(MCS)，能够同时表达两个目的蛋白。设计相应的引物以保留HA前端的信号肽序列并去除末端的跨膜区，将可溶性HA和HA1基因片段分别克隆至上游的多克隆位点，同时将人白细胞介素2(IL-2)基因克隆至下游的多克隆位点。将构建成功的真核表达质粒经肌肉注射免疫小鼠，检测小鼠的体液免疫反应和细胞免疫反应。 全文主要内容包括： 一，人H5N1流感病毒DNA疫苗的构建和鉴定。 二，人H5N1流感病毒DNA疫苗在真核细胞中的表达和检测。 三，人H5N1流感病毒DNA疫苗的免疫效果评价。 主要的研究结果如下： 1．人H5N1流感病毒DNA疫苗的构建和鉴定本室构建的pCR-BluntⅡ-TOPO-HA含有我国首株分离到的人H5N1亚型流感病毒的HA全长基因，我们以此作为模板应用PCR技术扩增得到可溶性HA(1593bp)和可溶性HA1(1032bp)基因片段。将其分别克隆至载体pGEM-T Easy，用Xho Ⅰ和Mlu Ⅰ双酶切鉴定，挑选正确的克隆进行测序。将测序正确的pGEM-T Easy-HA和pGEM-T Easy-HA1质粒经Xho Ⅰ和Mlu Ⅰ双酶切后电泳回收HA和HA1片段，然后将其插到真核表达载体pStar上游的多克隆位点。 此外，我们以含有人IL-2基因的质粒pCD-IL2作为模板应用PCR技术扩增得到人IL-2(465bp)基因片段。将PCR产物直接用BamH Ⅰ和NotⅠ双酶切，电泳回收IL-2片段并插到pStar下游的多克隆位点，酶切鉴定并挑选正确的克隆进行测序。由此，共构建了pStar-HA、pStar-HA-IL2、pStar-HA1、pStar-HA1-IL2和pStar-IL2五种真核表达质粒。 2．人H5N1流感病毒DNA疫苗在真核细胞中的表达和检测为检测我们构建的DNA疫苗在真核细胞中能否正常转录和翻译，选用真核细胞COS7和293T进行质粒DNA的转染和表达。 1) 可溶性HA和HA1蛋白在293T细胞中的表达和检测应用脂质体法将质粒pStar-HA、pStar-HA1和pStar分别转染293T细胞，48小时后收获细胞培养上清并用三氯醋酸进行浓缩。将浓缩的上清进行12％的SDS-PAGE电泳和Western blot检测。结果显示，转染pStar-HA的细胞上清在85kD附近有特异性条带，转染pStar-HA1的细胞上清在50kD附近有特异性条带，分别与HA和HA1蛋白的预期大小相符，而转染pStar的细胞上清中未见特异性条带。表明可溶性HA和HA1蛋白在293T细胞中成功地表达。 2) 可溶性HA和HA1蛋白在COS7细胞中的表达和检测应用脂质体法将质粒pStar-HA、pStar-HA1和pStar分别转染COS7细胞，24小时后用冷甲醇固定细胞，应用间接免疫荧光法检测HA和HA1蛋白的表达。结果显示，转染质粒pStar-HA、pStar-HA1的细胞孔有明显的黄绿色荧光，而转染pStar的细胞孔未见特异性黄绿色荧光。表明可溶性HA和HA1蛋白在COS7细胞中成功地表达。 3)IL-2蛋白在293T细胞中的表达和检测应用脂质体法将质粒pStar-HA-IL2，pStar-HA1-IL2、pStar-IL2和pStaur分别转染293T细胞，72小时后收获细胞培养上清，应用MTT法检测细胞上清中IL-2的生物学活性。结果显示，在转染重组质粒的细胞上清中检测到了IL-2的活性，而在转染pStar的细胞上清中没有检测到其活性，表明IL-2蛋白在293T细胞中成功地表达。 3.人H5N1流感病毒DNA疫苗的免疫效果评价大量制备重组质粒DNA，经肌肉注射免疫4～6周龄雌性BALB/c小鼠。将小鼠随机分为6组，每组5只，免疫剂量为100μg/只。共免疫4次，间隔18天。采集免疫小鼠的外周血和脾细胞，分别用于检测体液免疫反应和细胞免疫反应。 1) 免疫小鼠体液免疫反应的检测应用酶联免疫吸附实验(ELISA)和红细胞凝集抑制实验分别测定小鼠血清中HA特异性IgG抗体的滴度和血凝抑制抗体(HI)的滴度。结果显示，重组质粒pStar-HA、pStar-HA-IL2、pStar-HA1、pStar-HA1-IL2免疫组小鼠血清中的特异性IgG抗体滴度在免疫后逐渐升高，且具有抑制流感病毒凝集红细胞的能力，与对照组间存在显著性差异。说明重组质粒成功地在动物体内诱导了体液免疫反应。 2) 免疫小鼠细胞免疫反应的检测应用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测小鼠脾细胞分泌IFN-γ的能力，以评价DNA疫苗诱导细胞免疫反应的能力。将免疫小鼠的脾细胞用培养基调整至所需的细胞浓度，分别用合成的HA短肽和刀豆蛋白A(ConA)作为刺激物刺激24小时，最后通过计数斑点来判断细胞免疫反应的水平。从conA刺激的实验数据可以看出，重组质粒免疫组的斑点数目明显高于空载体对照组，说明DNA疫苗能够激活小鼠的细胞免疫反应。 综上所述，本研究将我国首株分离到的人H5N1流感病毒的HA和HAl基因及人IL-2基因克隆至真核表达载体pStar中，构建了DNA疫苗。可溶性HA、HA1和IL-2蛋白在真核细胞中成功表达。将质粒DNA通过肌肉注射免疫小鼠，诱导出了特异性体液免疫反应和细胞免疫反应。本研究是对人H5N1流感病毒DNA疫苗研究的尝试，为新型流感疫苗的研制奠定了基础。