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黑色素的数量、性质与分布能够决定哺乳动物毛发、皮肤颜色的形成。去泛素化酶（Deubiquitinating enzyme）是去泛素化特异性蛋白酶家族中重要的一类蛋白酶,可通过移除底物蛋白上的泛素阻止底物蛋白降解,保证底物蛋白稳定。课题组前期经过转录组数据分析发现,去泛素化酶USP13（Ubiquitin Specific Peptidase 13,USP13）直接参与獭兔黑色素生成过程,但具体作用机制尚不清楚。因此,本研究分析了 USP13在獭兔黑色素细胞色素沉积过程中的功能,揭示USP13的下游靶向信号通路,丰富毛皮动物色素沉积机理。1.明确USP13在黑色素生成中的功能。利用免疫组织荧光技术,检测USP13蛋白在獭兔皮肤中的定位情况,发现USP13蛋白在獭兔皮肤的表皮层、毛根及毛球部等多个部位表达。利用实时荧光定量 PCR（Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）和Wes（Simple Western system）技术,检测USP13在不同毛色獭兔皮肤中的表达水平,发现USP13在黑色獭兔皮肤中的mRNA和蛋白表达水平显著高于其它毛色（P＜0.05）,且在白色中最低。在黑色素细胞（Melanocytes,MCs）中过表达和干扰USP13,利用CCK-8和Annexin V-FITC方法检测MCs增殖和凋亡情况,发现USP13显著促进MCs增殖,抑制凋亡（P＜0.01）,并利用NaOH法测定黑色素含量变化情况,发现USP13促进黑色素生成。同时,USP13调控TYR、DCT、PMEL及GPNMB等黑色素相关基因的mRNA表达。以上结果表明,USP13影响MCs增殖和凋亡,调控黑色素相关基因的表达,参与MCs黑色素生成过程。2.揭示USP13在黑色素生成过程中上游调控机制。构建USP13启动子缺失片段载体,利用双荧光素酶报告系统,确定USP13启动子核心区域为-400～-300 bp。经ALGGEN PROMO在线软件预测发现,该区段存在SPF1、AP-3、NF-1、YY1及FOXO4转录因子的结合位点。进一步利用qRT-PCR技术发现FOXO4过表达显著抑制USP13的mRNA表达水平（P＜0.01）。利用定点突变技术,对FOXO4结合位点进行突变,结果发现FOXO4可以显著提高USP13启动子活性（P＜0.01）。EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）结果表明,FOXO4蛋白与USP13启动子序列特异性结合,结合位点为TGTTTAAGGA。以上结果表明,FOXO4可以与USP13启动子区特异结合,负调控USP13启动子活性。3.阐明去泛素化酶USP13在黑色素生成过程中的下游路径。构建了 pcDNA3.1（+）-Myc-USP13真核表达载体,转染MCs后,利用蛋白质组学技术,以P＜0.05筛选USP13调控蛋白,其中上调差异蛋白611个,下调差异蛋白585个,并利用PRM（Parallel Reaction Monitoring）验证差异蛋白,验证结果与蛋白组学结果一致。差异蛋白KOG功能注释在翻译后修饰、信号转导等条目,KEGG分析主要富集在蛋白酶体、黑色素生成等信号通路中。利用定量泛素化修饰组学技术,以P＜0.05鉴定USP13介导泛素化位点,其中491个泛素位点显著上调,223个显著下调。通过差异泛素修饰位点对应蛋白PPI（Protein-Protein Interaction）分析,发现这些位点集中分布于黑色素生成的多个代谢途径上。为了鉴定USP13直接作用的底物,在兔成纤维细胞（Rabbit fibroblasts）中过表达转染USP13,利用免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）技术筛选到3958个与USP13互作的蛋白。为了进一步确定USP13的直接底物蛋白,设置“蛋白表达上调,泛素水平降低,与USP13靶向结合”的筛选标准,进行三组学联合分析,精准筛选到底物蛋白7个,分别是 CMAS、TPD52L2、PSMC6、ABCC3、CAV1、CARMIL1、MYOF,初步认定为USP13在黑色素生成过程中的靶向底物。4.解析USP13调控靶蛋白CMAS去泛素化参与獭兔黑色素生成的作用机制。通过qRT-PCR和Wes技术检测CMAS在不同毛色獭兔皮肤中的表达情况,发现CMAS在黑色獭兔皮肤中表达水平最高（P＜0.05）,与USP13一致。在MCs中过表达和干扰CMAS,利用CCK-8和Annexin V-FITC方法测定MCs增殖和凋亡情况,发现CMAS显著促进MCs增殖,抑制凋亡,并利用NaOH法测定黑色素含量变化,发现CMAS促进黑色素生成。同时,CMAS调控TYR、DCT、MITF及GPNMB等黑色素相关基因的mRNA表达水平。进一步在MCs中过表达/干扰USP13,发现CMAS蛋白表达水平上调/下调,但其mRNA水平无显著变化（P＞0.05）,提示USP13对CMAS的调控发生在蛋白翻译后水平。将 Myc-USP13 和 Flag-CMAS 共转染 MCs,通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）验证二者结合关系,确定USP13与CMAS存在外源性结合。用环己酰亚胺（Cycloheximide,CHX）处理,在 0h、1h、4h 和 8h 检测 CMAS 蛋白水平,发现 USP13增强CMAS蛋白稳定性。将K48-Ub-HA和K63-Ub-HA质粒分别与Flag-CMAS和Myc-USP13质粒共同转染MCs,发现CMAS蛋白泛素化水平降低,且USP13主要通过K48-泛素连接位点介导CMAS去泛素化。以上结果表明,USP13靶向调控底物蛋白CMAS去泛素化,影响MCs增殖和凋亡,参与獭兔黑色素生成过程。