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验目的:课题组前期研究发现壁虎中抗肿瘤活性成分为蛋白质类大分子。本课题研究目的是分离纯化出壁虎中的抗肿瘤活性蛋白。实验方法:1壁虎抗肿瘤活性组分分离纯化方法(1)凝胶过滤层析:介质:Sephadex G-25,层析柱:D/H为1.6/50的中低压玻璃柱(柱体积100 mL),样品:鲜壁虎粗提液,上样量:4mL,洗脱液:高纯水。(2)离子交换层析:介质:DEAE-cellul实ose DE-52弱阴离子交换介质,层析柱:D/H为2.6/50的中低压玻璃柱(柱体积60 mL),样品:Sephadex G-25峰1,上样量:40mL,洗脱方式:阶段性洗脱,洗脱液:0.1 M NaCl溶液、0.2 MNaCl溶液、0.3 MNaCl溶液、0.5 MNaOH 溶液。(3)疏水层析:介质:苯基琼脂糖凝胶FF,层析柱:D/H为1.6/20的中低压玻璃柱(柱体积20 mL),样品:离子交换0.1 MNaCl组分,上样量:70mL,洗脱方式:阶段性洗脱,洗脱液:含 1.0 M(NH4)2SO4 母液、含 0.5 M(NH4)2SO4 母液、含 0 M(NH4)2SO4母液、纯水、0.5 MNaOH溶液阶段性洗脱。(4)高效凝胶过滤色谱:色谱柱:TSK-GELG4000PWxl柱,7.8*300mm,填料:聚甲叉丙烯酸甲酯,样品:疏水层析0.5 M(NH4)2SO4组分,上样量:20 μL,流动相:高纯水,流速:1.0 mL/min。(5)Sephadex G-200凝胶过滤层析:介质:Sephadex G-200,样品:疏水层析0.5 M(NH4)2SO4组分,上样量:4mL,洗脱液:高纯水,流速:0.1 mL/min。(6)Native-PAGE 凝胶电泳:介质:Native-PAGE 凝胶,样品:疏水层析 0.5 M(NH4)2SO4,上样量:15μL/孔,电泳条件:浓缩胶电压80V,分离胶电压180V。2各分离组分的活性检测方法(1)MTT法检测Bel-7402细胞增殖抑制作用;(2)显微镜下观察Bel-7402细胞形态。3样品蛋白浓度测定方法(1)BCA试剂盒测定样品中的蛋白浓度。实验结果:根据上述实验方法,对各分离组分进行活性检测实验,结果如下:1、壁虎粗提液经凝胶过滤层析Sephadex G-25分离得到三个峰,细胞实验表明峰1组分抗肿瘤活性最强,最高肿瘤抑制率为87.8%,IC50值为25.6 mg/mL。G-25峰1组分得率为5.98%(n=3)。重复三次实验G-25峰1的峰面积、起始时间、终止时间、峰宽、峰高没有显著性差异。2、Sephadex G-25峰1经DEAE-cellulose DE-52分离得到6个峰,细胞实验表明含0.1 M NaCl的20 mM pH 8.0 Tris-HCl洗脱组分(以下简称0.1 M NaCl组分)抗肿瘤活性最强,最高肿瘤抑制率为65.05%,IC50值为144.8 mg/mL。0.1 MNaCl组分平均得率为0.91%(n=3)。重复三次实验6个峰的的峰面积、起始时间、终止时间、峰宽、峰高没有显著性差异。3、O.lMNaCl组分经苯基琼脂糖凝胶FF疏水分离得到5个峰,细胞实验表明含0.1%NaCl的20mM pH 8.0Tris-HCl为母液配制成的0.5 M(NH4)2SO4为洗脱液的洗脱组分(以下简称0.5 M(NH4)2SO4组分)抗肿瘤活性最强,最高肿瘤抑制率为75.85%,IC50值为1.25 mg/mL。0.5 M(NH4)2SO4组分平均得率为0.44%(n=3)。重复三次实验5个峰的峰面积、起始时间、终止时间、峰宽、峰高没有显著性差异。4、高效凝胶过滤色谱:0.5 M(NH4)2SO4组分经高效凝胶过滤色谱分离,将分离过程流出的组分分五部分收集得到①?⑤样品,细胞实验表明①?⑤样品肿瘤抑制率分别为20.55%、43.43%、40.48%、54.63%、29.78%,将④号样品进一步分段收集得到1号?3号样品,1号?3号样品最高肿瘤抑制率分别为13.59%、7.24%、12.90%,1号?3号样品抑瘤率统计学分析没有显著性差异。5、Sephadex G-200凝胶过滤层析:0.5 M(NH4)2S04组分经凝胶过滤层析Sephadex G-200分离,将分离过程流出的组分分五部分收集得到1号?5号样品,细胞实验表明1号?5号样品最高肿瘤抑制率分别为74.12%、11.19%、18.10%、10.67%、30.26%。统计学分析1号样品与其他组有显著性差异。但Sephadex G-200凝胶过滤层析分离效果不佳。6、Native-PAGE凝胶电泳:将0.5 M(NH4)2S04组分经Native-PAGE电泳分上、中、下三部分回收蛋白,细胞实验表明上、中、下三部分各部分最高肿瘤抑制率分别为93.52%、65.21%、64.21%。上、中、下各部分回收得率分别为0.003%、0.035%、0.006%。推断壁虎抗肿瘤活性单一蛋白可能在最上部。结论:通过凝胶过滤层析、离子层析、疏水层析、Native-PAGE凝胶电泳,壁虎粗提液中抗肿瘤活性成分得到了分离纯化,最后得到比较单一的活性组分,推测活性成分分子量大于70 kD。