原发性肝癌(Primary liver cancer,PLC)是我国第4位常见的恶性肿瘤和第3位肿瘤致死病因,包括两种主要的组织学类型:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)和肝内胆管细胞癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC),其中HCC占我国肝癌总数的83.9%~92.3%。乙型肝炎病毒(HBV)感染和HCC发生的相关系早已明确。HBV感染导致的肝癌比例高达70%~80%,我国的肝癌患者多具有乙肝和肝硬化背景。第一部分转铁蛋白在HBV相关肝病血清中的变化及其临床意义转铁蛋白(Transferrin,TRF,TF)调控铁在体内的吸收、转运、利用和储存,并维持体内铁平衡。由于TRF主要由肝细胞分泌,肝脏疾病对TRF水平的影响及其临床意义具有研究价值。本部分研究对肝细胞癌(HCC)、肝内胆管癌(ICC)、肝硬化(Liver cirrhosis,LC)、慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)和健康体检者(Healthy control,HC)的血清TRF进行评估,并对血清TRF水平与疾病特征和相关临床指标进行分析。利用西门子BN-Ⅱ特定蛋白仪对685例样本血清进行检测,结果发现血清TRF水平在HCC、ICC、LC、CHB和HC组分别为1.82±0.50、1.83±0.58、2.32±0.70、2.57±0.82、1.40±0.59(均数±标准差,单位:g/L),LC、CHB组TRF水平显著高于HCC组(p<0.001),HC组TRF水平显著低于HCC组(p<0.001),ICC组TRF水平与HCC组无统计学差异(p>0.05)。血清TRF水平与多个实验室肝功能相关指标间具有相关性:与总胆汁酸(TBA,R=-0.135)、直接胆红素(DBIL,R=-0.085)等呈负相关(p<0.05),与白蛋白(ALB,R=0.262)、总蛋白(TP,R=0.218)、血小板(PLT,R=0.240)、红细胞(RBC,R=0.228)、血红蛋白(HGB,R=0.238)等呈正相关(p<0.05),与实验室指标白蛋白球蛋白比值(A/G)、总胆红素(TBIL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、甲胎蛋白(AFP)、癌抗原(CA19-9)等间无明显相关性(p>0.05)。但TRF在HCC不同临床分期和MVI分级间无差异。综合上述结果可知,HCC患者的TRF水平介于健康人和良性疾病之间,且和ICC无差异,因此TRF可能不适合单独应用于HCC的鉴别诊断。第二部分基于凝集素芯片的血清转铁蛋白聚糖结构分析糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,血清中50%-70%的蛋白均为糖基化修饰蛋白。异常糖基化改变与肿瘤的发生、发展和转移具有密切关系。凝集素芯片的应用使同时检测多种糖链结构种类和丰度成为可能。我们用含有45个凝集素的Lec Chip TM凝集素素芯片分析从HCC、ICC、LC和HC血清中分离纯化出的TRF,结果显示19个凝集素在HCC、ICC、LC、HC四组中的分布的差异具有统计学意义的差异(p<0.05)。在患癌组中高于非患癌组的凝集素有SNA、SSA,在non-CA中高于CA的凝集素有LTL、AOL、MAL、PHAL、ACG、ECA、RCA120、NPA、Con A、GNA、TJAⅡ、EEL、UDA、Jacalin、HPA、PTLⅠ。根据不同凝集素识别的特定糖链结构,本研究提示,在HCC、ICC、LC和HC四组中有差异的糖链结构主要包括核心岩藻糖(Fucα1-6Glc NAc)、唾液酸(Sia)、半乳糖β1-4连接的N-乙酰半乳糖胺(Galβ1-4Glc NAc)、三、四天线的复杂N-聚糖(Tri/Tetra-antennary complex-type N-glycan)和高甘露糖(High Man)结构等,患癌组的唾液酸结构显著高于非患癌组,其余结构主要在非患癌组增高。本研究提示,TRF糖链结构种类在不同肝脏疾病和健康人中具有较大差异。第三部分凝集素酶联免疫吸附法检测DSA-TRF的方法学建立及其在原发性肝癌诊断中的初步应用TRF是肝脏合成并分泌到血清中的一种高丰度糖蛋白,含有两个N-linked糖基化位点。正常人血清中的TRF基本只含有两条二天线糖链,肝癌患者血清中TRF糖链分枝增加。本研究自行建立凝集素酶联免疫吸附法(Lectin-ELISA)对多血清天线TRF进行检测。该方法效仿“三明治”法ELISA,用抗TRF抗体包被酶标板,抓取样本中的TRF,用曼陀罗凝集素(Datura stramonium agglutinin,DSA)代替检测抗体,识别TRF的多天线结构(DSA-TRF)。以倍比稀释的混合血清作为替代标准品建立浓度-梯度曲线,并评价该方法重复性和抗干扰性。结果显示批内最大变异系数(CV%)为7.72,批间最大变异系数(CV%)为9.34,各干扰物质对该体系无明显干扰。通过对HCC、ICC、LC、CHB和HC血清样本进行检测,。通过对685例样本的检测,发现HCC组DSA-TRF(0.282±0.06)显著高于疾病对照组(0.200±0.07)和健康对照组(0.238±0.100)(p<0.001),患癌组DSA-TRF显著高于非患癌组(vs 0.208±0.084,p<0.001),甲胎蛋白(AFP)阴性的HCC患者DSA-TRF显著高于非患癌组(0.276±0.067 vs 0.208±0.084,p<0.001)。用Logistic回归方法构建诊断模型Logit TRF1(=55.711×DSA-TRF/TRF-8.057×DSA-TRF+0.017×AFP-0.077×TBIL+0.357×ALB-16.437)用于HCC与高危人群(LC、CHB)的鉴别诊断,Logit TRF2(=24.125×DSA-TRF-2.279×TRF-24.346×DSA-TRF/TRF-0.059×TBIL+3.315)用于AFP阴性HCC和non-HCC的鉴别诊断。通过受试者工作曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)分析DSA-TRF和Logit TRF1、Logit TRF2对不同疾病组的诊断价值,发现鉴别HCC与良性疾病(LC、CHB)时,DSA-TRF曲线下面积(AUC)达0.859(95%CI:0.818~0.900);Logit TRF1的AUC达0.981(95%CI:0.971~0.992)。鉴别AFP阴性HCC与非肿瘤对照时,DSA-TRF的AUC达0.775(95%CI:0.726~0.824);Logit TRF2的AUC达0.839(95%CI:0.799~0879)。本研究提示,DSA-TRF和诊断模型Logit TRF1、Logit TRF2对HCC以及AFP阴性HCC的鉴别诊断可能具有应用前景。第四部分凝集素酶联免疫吸附法检测DSA-AGP及其在原发性肝癌诊断中初步的应用α1-酸性糖蛋白(α1-Acidglycoprotein,AAG/AGP)是肝细胞合成分泌至血浆的一种急性时相蛋白,是血清中含糖量较高的特定蛋白之一,具有5个N-linked糖基化位点。在HCC中,异常岩藻糖基化的AGP已有相关报道,但关于HCC中AGP的多天线糖链如何改变尚缺乏相关文献报道。本研究建立了凝集素酶联免疫吸附法(Lectin-ELISA)检测HCC、ICC、LC、CHB和HC样本血清中多天线AGP(DSA-AGP)水平,同时配对检测样本血清AGP水平。结果提示HCC组DSA-AGP(0.471±0.07)显著高于疾病对照组(0.443±0.09)和健康对照组(0.389±0.10)(p<0.001);HCC组AGP显著高于HC(0.63±0.30 vs 0.45±0.15,单位:g/L,p<0.001)。患癌组(HCC和ICC)DSA-AGP和AGP显著高于非患癌(0.462±0.08 vs 0.428±0.10;0.67±0.32 vs 0.52±0.28,单位:g/L,p<0.001)。AFP阴性HCC患者血清DSA-AGP和AGP显著高于non-HCC患者(0.478±0.09 vs 0.428±0.10,p<0.001;0.60±0.28 vs 0.52±0.29,单位:g/L,p<0.05)。用Logistic回归方法联合DSA-AGP、AGP和临床指标(AFP、TBIL、ALB)构建了两个诊断模型:Logit AGP1(=6.578×DSA-AGP+1.445×AGP+0.013×AFP-3.258)用于HCC与非肿瘤对照的鉴别诊断,Logit AGP2(=6.912×DSA-AGP-0.126×TBIL-0.193×ALB+6.417)用于AFP阴性HCC与非肿瘤对照的鉴别诊断。ROC曲线分析血清DSA-AGP、AGP、Logit AGP1和Logit AGP2的诊断价值发现诊断HCC时,Logit AGP1的AUC达0.836(95%CI:0.797~0.874),显著高于DSA-AGP(0.651,95%CI:0.594~0.707)、AGP(0.632,95%CI:0.577~0.687)及AFP(0.803,95%CI:0.748~0.836)单项;诊断AFP阴性HCC时Logit AGP2的AUC达0.929(95%CI:0.899~0.959),显著高于DSA-AGP(0.669,95%CI:0.603~0.735)和AGP(0.607,95%CI:0.536~0.678)单项。本研究提示DSA-AGP对HCC及AFP阴性HCC的鉴别诊断可能具有应用前景。