甘丙肽(galanin)是脑内重要的神经肽之一,由29个氨基酸(人类是30个氨基酸)组成。甘丙肽受体的三个亚型已被克隆,分别是甘丙肽1型受体(GalR1),甘丙肽2型受体(GalR2)和甘丙肽3型受体(GalR3),它们均属于G蛋白耦联受体家族。甘丙肽及其受体在中枢和外周神经系统内具有较广泛的分布,其中GalR2广泛存在于中枢和外周神经系统及许多外周组织如输精管、前列腺、子宫、卵巢、胃及小肠等。以往研究主要运用放射性配体结合自显影技术,原位杂交,RT-PCR方法分析这三种受体在神经系统的分布。1998年,Wang等人运用N端标记有荧光素的galanin,结合细胞流式的方法来研究甘丙肽受体内化过程。但由于缺乏选择性抗体以及工具药,有关甘丙肽受体膜转运和信号传导机制的研究一直难以深入。　　 本实验室构建并报导了与EGFP融合的GalR2在PC12细胞表达、内化和胞内转运。但由于EGFP本身是个大分子蛋白(240个氨基酸),无法完全排除EGFPs本身对GalR2膜转运的影响。为了更全面地研究和探讨GalR2膜转运机制,我们选择了另一类标记物即表位标签对GalR2进行标记。本实验构建了Myc-GalR2真核表达载体并将其转染到HEK293细胞,发现GalR2与配体甘丙肽结合后会迅速发生内化,5min时可见膜上Myc-GalR2明显减少,15min时细胞膜上Myc-GalR2几乎全部消失而胞浆内Myc-GalR2明显增多,并呈颗粒状。结果与我们用GalR2-EGFP观察到的结果吻合,进一步确认了GalR2的细胞表达、内化和胞内转运过程。表明在HEK293细胞内,GalR2受体蛋白转运呈配体依赖,时间依赖性的内化过程。同时我们通过测定胞内钙水平和MAPKs通路的激活情况来检测其信号通路激活情况,表明Myc对GalR2功能没有明显影响。在此基础上,本实验通过构建GalR2C尾巴平截突变体,来检测C端对于GalR2转运的影响。结果显示相比较野生型GalR2,Myc-GalR2ΔC主要表达在胞浆内,膜上表达很少,提示GalR2 C端对于GalR2的膜转运包括上膜机制(受体的囊泡分选、转运和插入)非常重要。　　 同时我们也最先报道了GalR2融合蛋白在培养的海马神经元上的表达。此外,我们将Myc融合在GalR2氨基端(N端),使得以后可以特异地标记和提取位于细胞表面的GalR2并进行定量分析,因此.Myc-GalR2细胞模型的成功构建,对深入探讨GalR2受体的膜转运机制有着重要的意义。同时该细胞模型也可用于GalR2细胞内信号传导及机制的研究,如结合不同的表位标签探讨信号传导过程中蛋白-蛋白相互作用机制。