琥珀酸是一种重要的平台化合物，由于琥珀酸具有很大的应用潜力，它被认定为最重要的生物基大宗化学品之一。在大肠杆菌中提高琥珀酸合成的方法包括:阻断竞争性途径、激活乙醛酸支路、过表达琥珀酸生产的关键酶以及提高能量和还原当量的供应等。本实验室已经构建了一系列产琥珀酸大肠杆菌，本文首次通过底物比例的调整，以及呼吸链的改造、ATP无效循环等一系列策略来调节菌株胞内ATP的产生和NADH/NAD+比例，达到提高琥珀酸产量和产率的目的。　　葡萄糖和木糖是纤维素水解液的主要成分，我们构建的产琥珀酸大肠杆菌YL104H可以以葡萄糖为底物高效的生产琥珀酸。进一步的研究发现YL104H也可以利用葡萄糖和木糖的混合糖来生产琥珀酸。然而，在发酵的厌氧阶段以单一的木糖为底物时YL104H菌株不能积累琥珀酸，我们推测可能是由于以木糖作为底物时厌氧生产能量供应不足导致的。通过分析以单一葡萄糖或单一木糖为底物时厌氧阶段ATP的产生情况。我们发现胞内ATP的水平会影响琥珀酸的产量，通过简单的调节底物中葡萄糖与木糖的比例就可以起到调节菌株胞内ATP水平的作用。之前的研究都是通过增加ATP的供应来提高琥珀酸的产量，本研究首次通过调控胞内ATP的产生达到最优水平，以此来提高琥珀酸生产。YL104H菌株以不同比例的混合糖的发酵生产琥珀酸，发现当葡萄糖与木糖的比例为1∶2的时候琥珀酸产量最高。接着我们利用人工调配的最佳葡萄糖与木糖的比例进行发酵优化，发现琥珀酸的产量可以达到一个比较高的水平。最后我们以木糖醇生产过程中得到的木糖废液作为发酵底物，YL104H菌株的琥珀酸产量达到61.66 g/L，全阶段的琥珀酸生产力为0.95 g/L/h。　　实验室已构建的产琥珀酸工程菌株YL104也可以利用葡萄糖高效的生产琥珀酸，但全阶段琥珀酸产率仍有待提高。在本研究中，我们探究了以葡萄糖为底物时菌株胞内NADH/NAD+比例、ATP水平和全阶段琥珀酸产率三者之间的关系。首先通过代谢工程改造使YL104菌株在有氧和厌氧阶段均使用厌氧NADH脱氢酶，改造后的工程菌株全阶段琥珀酸产率提高了7％。为了进一步降低转厌氧时菌株胞内的NADH/NAD+比例，我们在YL104N菌株中异源表达来自酿酒酵母胞质可溶的延胡索酸还原酶FRDS，得到的工程菌株全阶段琥珀酸产率提高了13％，菌株厌氧胞内的NADH/NAD+比例与ATP水平都有所下降。我们还在厌氧阶段采用ATP无效循环策略使菌株YL104NP厌氧琥珀酸产量有了明显提高，全阶段琥珀酸产率提高了17％。同时采用过表达异源的FRDS和ATP无效循环策略，菌株全阶段琥珀酸产率达到1.36 mol/mol，相比于亲本菌株YL104提高了39％。提高能量和还原力的供应是提高琥珀酸产量常用的方法，本论文发现将胞内NADH/NAD+比例和ATP水平调控到一个合适水平更有利于增强琥珀酸合成，并且这些调节胞内NADH/NAD+比例和ATP水平的方法也可以应用在其他厌氧产物的生产过程中。