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第一部分LTA模拟肽在金葡菌系统性感染模型中的保护作用研究背景:脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)是金葡菌细胞壁重要的保守成分,参与细菌对宿主细胞的黏附及介导细菌感染后的炎症反应。由于LTA属于TI抗原、免疫原性弱,因此限制其成为疫苗候选。目的:利用前期工作所得、模拟LTA表位的序列GHKEDRQWCQHS,合成四分枝多价抗原肽MAP2-3,观察MAP2-3作为免疫原免疫后诱导的免疫应答规律和特点以及在金葡菌系统性感染模型中的保护作用。方法:体外鉴定MAP2-3的抗原性。MAP2-3免疫小鼠,观察小鼠体内抗体生成规律及特点,MAP2-3免疫在脓毒症休克和脏器脓肿模型中的保护作用。结果:根据GHKEDRQWCQHS序列合成线性肽(序列为Bio-HSGHKEDRQWCQHSGG,命名为L2-3)和四分支多价抗原肽(命名为MAP2-3)。ELISA结果显示L2-3特异性结合抗LTA单抗;MAP2-3能分别与抗LTA单抗、抗金葡菌多克隆抗体结合。MAP2-3免疫小鼠后,免疫血清能与MAP2-3、LTA及金葡菌超声裂解产物特异性结合;抗体类别鉴定表明,MAP2-3免疫主要诱导IgG类抗体,末次免疫4周后仍能在MAP2-3免疫组小鼠体内检测到针对LTA的IgG类抗体。金葡菌致死性攻击后,对照组小鼠在4天内全部死亡,而MAP2-3免疫组10天生存率达60%以上,显著高于对照肽免疫组和空白组。金葡菌系统性感染模型中,MAP2-3免疫组小鼠脾脏、肾脏、肺脏中细菌载量显著低于对照肽免疫组和空白组。MAP2-3免疫组小鼠在感染早期脾脏中IFN-γ、IL-17A/F、IL-4和CCL3含量显著增高。体外实验表明MAP2-3免疫组小鼠脾脏中记忆性B细胞(IgG+B细胞及IgG1+B细胞)显著多于对照肽免疫组和空白组。结论:四分支多价抗原肽MAP2-3模拟LTA表位,MAP2-3免疫后可诱导小鼠体内产生针对LTA的IgG类抗体,并保护小鼠抵御金葡菌系统性感染。第二部分 Pam3CSK4预处理降低MRSA感染中炎症反应研究背景:机体在应对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)系统性感染中产生大量促炎性细胞因子以激活免疫系统清除细菌,但促炎性细胞因子过度分泌(也称为细胞因子风暴)导致组织损伤,甚至参与脓毒症性休克的发生与发展。有文献表明不同TLR激动剂LPS、PGN、单磷酰脂质(MPLA)等预处理后,可以降低小鼠在金葡菌感染模型中炎症反应及提高其生存率,但Pam3CSK4预处理降低MRSA感染中炎症反应机制尚不清楚。目的:观察TLR2激动剂Pam3CSK4预处理对MRSA系统性感染中炎症反应的影响并初步探讨其机制。方法:于感染前48 h和24h连续两次对BALB/c、C57BL/6鼠及TLR2-/-鼠(雌性,6-8周)行尾静脉注射Pam3CSK4,对照组加无菌PBS处理。以1×108 CFU/只MRSA(ATCC43300)致死性攻击(iv),观察各组小鼠生存率;以2×107 CFU/只MRSA静脉感染小鼠,比较Pam3CSK4预处理组和对照组血液和组织中的细菌残存量,HE染色观察小鼠肾组织中性粒细胞浸润及脓肿,ELISA检测脏器中细胞因子的产生,real-time PCR检测TLRs、NOD2、IRAKs及Tollip相对表达量,Western Blot检测NF-κB磷酸化、IRAK-M及Tollip表达,免疫沉淀检测IRAK-1与MyD88、IRAK-1与TRAF6的结合。结果:在致死性感染模型中,Pam3CSK4预处理的BALB/c鼠和C57BL/6小鼠的生存率显著高于对照组,而Pam3CSK4预处理不能降低TLR2-/-小鼠死亡率。在菌血症模型中,Pam3CSK4预处理组外周血和各脏器中的细菌残存量显著减少,肾组织中脓肿及中性粒细胞浸润明显少于对照组,Pam3CSK4处理组在感染后血清、肾脏、脾脏中促炎性细胞因子含量显著降低,而肾组织、脾脏中IL-10、TGF-β表达量增高;real-time PCR结果显示,Pam3CSK4预处理组组织中TLR2相对表达量下降。Pam3CSK4预处理组在感染后脾脏中IRAK-4和IRAK-1表达量下降、NF-κBp65磷酸化降低,IRAK-1与TRAF6结合降低,而IRAK-M、Tollip表达量显著升高。结论:Pam3CSK4预处理可能通过下调TLR2信号通路中多个分子以降低MRSA系统性感染中炎症反应。