研究背景　　抑郁症是全球越来越关注的重大精神疾病;这种精神疾病主要特征以情绪低落、兴趣或乐趣缺乏、 持续性疲劳、生活原动力低下为主要;在当今社会引起越来越广泛的关注[1]。　　抑郁症的高发病率、高复发率、高致残率和高自杀率;治愈率低;这不仅给个人和家庭都带来了沉重的负担。根据2017年最新WHO关于抑郁症病人的数据可知;全球有 3 亿人正在遭受抑郁症的折磨鉴于它导致逐年递增的高自杀率以及与其它心脑血管疾病和脑血管疾病共患病致死;让抑郁症更为让人们恐慌和引起广泛高度重视的是其被认为是一种可以致死的精神疾病[2]。　　令人苦恼的是抑郁症的病理生理机制到目前为止并不清楚;尽管基于抑郁症的单胺类神经递质假说;抑郁症的炎症因子假说和抑郁症的HPA轴紊乱学说和海马神经发生学说部分解释了抑郁症发生的可能原因;但是从疾病研究层面上;抑郁症的病理生理机制仍然不清。　　对抑郁症的研究另外一个亟待解决的问题和挑战是治疗困难;在抑郁症的临床治疗史上;已证实的抗抑郁药物的抗抑郁效应只能部分有效;并且开始产生抗抑郁效应的时间周期长达数周;持续时间非常有限。虽然国际新开展的电惊厥治疗（ECT）能够部分缓解这种困境;然而这种治疗带来的副作用例如逆行性遗忘却不容忽视[3]。在全球越发广泛对抑郁症这一疾病的关注下;通过进一步研究寻找到某一关键蛋白或者基因而进一步阐释抑郁症的可能病理生理机制以及治疗药物靶点显得格外重要。　　蛋白质组学如今已成为后基因组时代生物学研究新的热点;通过我们实验室稳定的蛋白质组学平台;对大量临床抑郁症病人的外周血浆标本运用基于2D双向凝胶电泳偶联质谱技术的策略发现了Car1是潜在的抑郁症生物标志物;本研究中拟进行探讨Car1是否可能参与抑郁症的病理生理机制调控并能够发挥抗抑郁症状的效果。　　目的　　1. 为了证实本实验室前期发现的Car1与抑郁症的相关性;我们通过构建不同的啮齿类（大/小鼠模型）抑郁模型（CUMS 模型和 CSDS模型）、首发未用药重型抑郁症病人和服用抗抑郁药物的重型抑郁症外周血清;以及借助团队前期成功构建的自然抑郁食蟹猴模型和 V-C 食蟹猴拘禁模型的标本对Car1蛋白与抑郁症的相关性进行研究。　　2. 拟验证潜在的调控Car1上游的转录调控因子GATA-1是否存在调控关系和是否参与抑郁症病理生理的调控机制。　　3. 通过 C57 小鼠在体给予 Car1 激动剂 L-Phe 匹配行为学以及MAPK-ERK和NF-kB信号通路验证;离体小鼠海马的原代神经元给予激动剂 L-Phe 后做相应的信号通路验证;随后通过借助构建 Car1 Lenti-virus 慢病毒质粒对 C57 海马脑组织定位注射匹配检测抑郁相关和焦虑相关行为表型。在此基础上;我们借用 CO-IP 偶联质谱技术和初步 WB 验证寻找和证实与 Car1 相互作用的抑郁症高度相关的蛋白MAO-A。4. 为了探寻 Car1 与抑郁症的因果关系;我们成功构建了Car1-KO小鼠和Car1-CKO小鼠。　　5. 为了证实Car1基因敲出鼠的行为表型特征和其分子证据;我们研究了基因敲出鼠的抑郁症和焦虑相关行为表型以及叠加社会挫败模型后行为表型分析;同时也通过表达谱芯片寻找导致相关改变的信号通路以及验证。依据文献报道抑郁症会影响学习认知的改变;我们又采用膜片钳电生理场电位记录偶联电信号相关改变的受体WB验证。　　方法　　本研究主要采用针对上游转录调控子（ChIP偶联PCR和荧光报告基因实验）的预测和验证;以及对目标基因Car1与抑郁症的相关性研究;通过干预上调Car1（激动剂在体和离体实验+脑区定位注射过表达慢病毒质粒）匹配抑郁和焦虑相关行为表型和信号通路验证;在初步证实Car1与抑郁症相关的前提下;我们拟使用蛋白互作手段寻找和验证与 Car1 互作的蛋白;随后对 Car1 与抑郁症的因果关系研究;我们采用构建基因敲出鼠;并对基因敲出小鼠初步检测抑郁和焦虑相关行为表型并使用表达谱芯片和初步验证相关责任通路;并对基因敲出小鼠采用膜片钳电生理场电位记录的手段匹配相关受体WB验证。　　主要方法如下：　　1;我们对不同抑郁动物模型（CUMS大鼠抑郁模型;CSDS小鼠抑郁模型;自然抑郁食蟹猴模型;V-C 拘禁食蟹猴模型）和首发未用药重型抑郁症病人和服用氟西汀和文拉发辛病人外周血清进行Car1的Western Blotting验证。　　2;我们针对数据库预测和文献报道的调控抑郁症的转录调控子GATA-1的转录调控验证;使用ChIP+PCR偶联荧光报告基因实验寻找转录调控结合位点。　　3;我们使用腹腔注射 Car1 的激动剂 L-Phe 后匹配抑郁相关和焦虑相关行为学实验和海马脑组织的相关信号通路验证（ NF-kB 和MAPK-ERK信号通路）;随后我们使用Car1-Lentivirus过表达慢病毒质粒对正常对照C57后匹配抑郁和焦虑相关的行为表型实验;使用CO-IP偶联质谱和免疫荧光共定位对Car1相互作用的蛋白进行寻找和验证。　　4;采用Cre-LoxP打靶技术构建了Car1全基因敲出小鼠（Car1-KO）和Car1条件基因敲出小鼠（Car1-CKO）。　　5; 对基因敲出小鼠进行行为实验和安捷伦表达谱芯片;通过 IPA预测通路并对通路进行验证;通过膜片钳电生理场电位记录海马 LTP并匹配电信号改变相关受体的WB验证。　　结果　　1;通过不同抑郁动物模型和抑郁症病人（用药和未用药）的WB验证发现;Car1在CUMS大鼠海马和CSDS小鼠海马显著下调;而在CSDS小鼠的前额叶没有统计学差异;首发未用药的抑郁症病人外周血浆表现为上调;而用药后的抑郁症病人则表现为Car1更加显著的上调。而在自然抑郁食蟹猴模型和 V-C 拘禁食蟹猴抑郁模型的外周血清则没有统计学差异改变。　　2; 用荧光报告基因实验证实了GATA-1转录调控目标蛋白Car1;并且通过构建GATA-1的lenti-virus慢病毒过表达质粒到HEK293细胞株提示抑制了Car1的表达;提示GATA-1有可能在小鼠海马通过转录抑制Car1参与抑郁症的病理生理机制的发生。　　3;在使用Car1激动剂腹腔注射的正常C57小鼠表现为广泛抗抑郁行为表型;在使用Car1激动剂腹腔注射CSDS社会挫败模型小鼠后也表现为更加明显的抗抑郁行为表型;随后的 C57 小鼠海马脑区定位注射后相一致的表现为广泛的抗抑郁行为表型。通过在体和离体 WB验证;我们发现MAPK-ERK通路中的P-c-raf和NF-kB信号通路中的IKKβ 相比于正常对照组显著下调。随后通过 CO-IP 偶联质谱技术和WB验证以及免疫荧光免疫共定位证实MAO-A是作为和Car1相互作用的蛋白;提示可能通过MAO-A参与抑郁症的病理生理机制。　　4;成功使用KO-First构建Car1-vector质粒和构建Car1-KO全基因敲出鼠和Car1-CKO条件基因敲出鼠。　　5;对基因敲出鼠检测抑郁和焦虑相关的行为学实验证实全敲小鼠存在焦虑和抑郁相关表型。对 Car1-CKO 条件敲出小鼠的海马相比较于野生型小鼠采用安捷伦表达谱芯片提示 Car1 会上调 IL-17A信号通路;并通过WB验证发现在CSDS模型小鼠海马IL-17A相比于正常对照小鼠表现为下调;通过膜片钳场电位记录Car1-KO小鼠（雌性和雄性）揭示全基因敲出鼠（雄性和雌性）的 fEPSP 显著比野生型小鼠增强;最为突出的是雄性Car1-KO小鼠显著增强（P=0.001;改变倍数值为1.8倍）;随后对Car1-CKO组; Car1-KO 组和野生型对照小鼠间的NMDA2A; NMDA2B; PSD95和AMPA受体的WB验证证实NMDA2A和AMPA受体在Car1-CKO和Car1-KO小鼠有显著的升高; 最为显著的是在Car1-KO小鼠上调表达最为显著（P=0.001）。　　结论　　1;Car1与抑郁症有紧密的关系;在过表达或者激活的Car1可以改善抑郁症。　　2;GATA1转录抑制Car1可能参与了抑郁症的病理生理机制。　　3; Car1有可能通过与MAO-A蛋白互作从而参与抑郁症的病理生理机制。　　4; Car1的敲出鼠证实了Car1的确实可以通过IL-17A信号通路导致焦虑易感和抑郁易感;并有可能通过增强NMDA2A和AMPA改善学习记忆。