研究背景:抑郁症是一种原因复杂、症状多发、发病率高的情感障碍型疾病。为应对抑郁症发病率日益增高的压力,世界各国对其研究的投入也会日益增多。同时,研发更加快捷、有效、经济的抗抑郁药物需要大量的实验研究,这将以消耗大量的实验动物为代价。而我国在努力推行实验动物福利伦理审查标准化,并制定推出了“新国标”,强调了替代、减少、优化(3R)原则。因此,本文在完成广东省科技厅项目“利用在体动物和海马神经细胞开展抑郁症动物实验的代替方法研究”课题的基础上,开展皮质酮致细胞损伤与CUMS抑郁症大鼠模型的相关性及β-细辛醚保护作用的研究,进一步寻找抑郁症动物实验的部分代替方法,以减少实验成本、提高效率,贯彻执行新标准。目的:利用慢性不可预见性温和刺激(CUMS)建立SD大鼠抑郁模型和皮质酮(CORT)致细胞损伤模型,以实验结果为基础,以相关性分析为依据,探讨部分代替或减少实验动物使用量的方法,初步研究β-细辛醚对神经细胞的保护作用。方法:①将SPF级SD大鼠为正常组、模型组和氟西汀组,利用竭力游泳、电击足底、夹尾、禁水、禁食、昼夜颠倒、拥挤等造模方法制作CUMS抑郁模型,整个过程持续6周。根据大鼠的外观形态等表现进行抑郁评分,同时观察体重变化。造模第4周,氟西汀组开始干预。6周后,根据大鼠抑郁评分和体重变化判断造模是否成功。实验结束后大鼠取血、取脑及制备含药血清,血清测定皮质酮及神经递质(5-HT、DA、NE)含量,脑组织测定神经递质及IL-10、TNF-α、BDNF、pERK及VGF含量。②按分组获取大鼠的海马组织进行细胞培养,利用含药血清干预后检测神经递质及细胞存活率。同时,对上述实验的数据结果进行相关性分析,寻找该模型下与抑郁密切相关的因素。③利用CORT损伤细胞制备细胞模型,检测乳鼠海马神经细胞与PC12细胞的存活率,并与CUMS抑郁大鼠的海马神经细胞存活率做对比研究,探索使用该细胞模型进行实验的可行性。同时,检测β-细辛醚干预下细胞存活率的变化。④利用β-细辛醚对细胞模型进行干预,检测细胞模型中IL-10、TNF-α、BDNF、pERK以及VGF的含量,并分别将细胞模型与CUMS抑郁大鼠的检测指标进行相关性分析,探索代替或减少实验动物使用量的方法。结果:1.CUMS抑郁大鼠的抑郁评分模型组的大鼠抑郁评分明显高于正常组和氟西汀组。模型组的抑郁评分与正常组、氟西汀组比较有显著性差异。氟西汀组大鼠的抑郁评分低于模型组,但是高于正常组。2.CUMS抑郁大鼠的行为学变化造模前大鼠的行为学指标无明显差异。第2周开始,模型组、氟西汀组的体重开始下降,旷场实验的水平、垂直运动和自发活动的得分均明显减少,糖水偏爱度下降,强迫游泳时间缩短,与正常组比较存在显著性差异。第4周,氟西汀组开始药物干预后,与正常组的差异性逐渐减小,与模型组的差异性逐渐增加并开始出现显著性差异。3.CUMS抑郁大齪血清皮质酮及神经递质的含量变化模型组血清中皮质酮的含量明显升高,与正常组比较有显著差异。氟西汀组血清皮质酮的含量明显降低。模型组血清中NE、DA、5-HT的含量明显降低,与正常组比较有显著差异。氟西汀组血清中NE、DA、5-HT的含量显著提高。但未达到与正常组水平。4.CUMS抑郁大鼠不同部位脑组织神经递质的含量变化模型组海马、皮质、中脑、纹状体的NE、DA和5-HT的含量降低明显,与正常组比较有显著性差异。氟西汀组海马、皮质、中脑、纹状体的NE、DA和5-HT的含量明显提高,除去中脑的DA、5-HT外,其他部位脑组织的NE、DA和5-HT含量均高于模型组。5.CUMS抑郁大鼠海马组织IL-10、TNF-α、BDNF、pERK、VGF的含量变化模型组海马组织的TNF-α、pERK的含量升高明显,与正常组比较有显著差异。氟西汀组海马组织的TNF-α、pERK的含量明显降低,与模型组比较有显著差异。模型组海马组织的IL-10、BDNF、VGF的含量降低明显,与正常组比较有显著差异。氟西汀组海马组织的IL-10、BDNF、VGF的含量显著提高,与模型组比较有显著差异。6.CUMS抑郁大鼠海马神经细胞的存活率及神经递质含量变化模型组的海马神经细胞存活率降低明显,与正常组比较有显著差异。氟西汀组的海马神经细胞存活率显著提高,与模型组比较有显著性差异。模型组海马神经细胞的NE、DA、5-HT的含量升高明显,与正常组比较有显著差异。氟西汀组海马神经细胞的NE、DA、5-HT的含量有所降低,其NE、DA的含量与模型组比较有显著差异。7.皮质酮损伤神经细胞存活率的变化①CORT损伤乳鼠海马细胞模型中,模型组的细胞存活率降低明显,与正常组比较有显著差异。β-细辛醚低剂量组、β-细辛醚高剂量组、氟西汀组的细胞存活率有所提高。β-细辛醚低剂量组的细胞存活率低于高剂量组与氟西汀组。②CORT损伤PC12细胞模型中,模型组的细胞存活率降低明显,与正常组比较有显著差异。β-细辛醚低剂量组、β-细辛醚高剂量组、氟西汀组的细胞存活率有所提高,但不及正常组水平。β-细辛醚低剂量组的细胞存活率接近高剂量组,但二者明显低于氟西汀组。8.皮质酮损伤神经细胞的细胞因子、神经营养因子含量变化①皮质酮致乳鼠海马神经细胞损伤实验:模型组的TNF-α、pERK的含量升高明显,与正常组比较有显著差异。β-细辛醚组的TNF-α的含量降低,与模型组比较均有显著差异。氟西汀组的TNF-α、pERK的含量降低明显,与模型组比较有显著差异且接近正常组水平;模型组的BDNF、VGF的含量降低明显,与正常组比较有显著差异。β-细辛醚组的IL-10、VGF,氟西汀组的IL-10、BDNF、VGF的含量升高明显,与模型组比较均有显著差异。②皮质酮致PC12细胞损伤实验:模型组的TNF-α、pERK的含量升高明显,与正常组比较有显著差异。β-细辛醚组的TNF-α、pERK的含量有所降低,与模型组比较有显著差异。氟西汀组的TNF-α、pERK的含量降低明显,与模型组比较有显著差异且接近正常组水平;模型组的IL-10、BDNF、VGF的含量降低明显,与正常组比较有显著差异。β-细辛醚组IL-10、VGF的含量升高,与模型组比较有显著差异。氟西汀组的IL-10、BDNF的含量升高明显,与模型组比较有显著差异。9.皮质酮致神经细胞损伤与CUMS抑郁模型大鼠的相关性分析皮质酮损伤的乳鼠海马神经细胞、PC12细胞与大鼠海马神经细胞密切相关,三者的细胞存活率的表现基本一致。CUMS抑郁大鼠模型海马组织的IL-10、TNF-α、BDNF、pERK及VGF含量也与皮质酮损伤神经细胞的含量表现一致。同时,两者与抑郁的相关性一致且两者之间具有显著相关性。PC12细胞模型与海马细胞模型的实验表现一致且两者相关性密切。结论:CUMS模型大鼠的抑郁表现稳定,其抑郁形态外观评分与行为学指标的观察评分相一致。过高的CORT不但会对单胺类递质系统功能造成损害,而且还会对海马神经细胞造成伤害并抑制其再生。CORT损伤的细胞模型在细胞存活率、细胞因子和神经营养因子等指标的含量变化上与CUMS抑郁大鼠的表现基本一致,且具有密切相关性。PC12细胞模型在细胞存活率、对氟西汀和β-细辛醚的反应性表现上与乳鼠海马细胞模型基本一致,且相关性显著。细胞模型可以在细胞因子、神经营养因子等与抑郁有关的实验中部分代替或减少抑郁症实验动物,并且可以用来进行抗抑郁药物或有效成分的初筛实验以及某些机制的研究。同时,PC12细胞模型可以代替乳鼠海马细胞模型进行相关的实验。