黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)属于变形细菌的δ分枝，具有滑动运动、子实体分化发育和群体捕食行为等复杂的多细胞行为，并且能够形成自然界最复杂的一类生物膜。在M.xanthus野生菌细胞表面分布了一层荚膜状物质，称为胞外基质(ECM)，是社会性运动(S运动)所必需的，同时又构成了子实体和生物膜的骨架结构，对M.xanthus细胞在自然界的生存起到了至关重要的作用。M.xanthus的胞外基质包含了基本等量的胞外多糖(EPS)和蛋白质，EPS形成了胞外基质的骨架结构，而蛋白分子依附在EPS骨架上，两者共同组成了胞外基质的主体结构。M.xanthus胞外基质除了与运动和发育相关外，还被认为是细胞粘附聚集的物质基础，其EPS组分被认为与M.xanthus在液体培养基中的聚团生长特性相关。EPS缺失突变株的细胞在液体中能够分散生长。然而，许多Myxococcus野生菌株在液体培养基中不能分散生长，而多以菌膜或菌团的形式存在，这非常不利于实验室条件下对菌株的操作。但是，目前关于液体生长条件下，EPS所行使的具体功能还没有深入的研究。　　 同时，许多细菌的生物膜中存在胞外DNA(ecDNA)，并被认为是细菌胞外基质的重要功能组分之一。己报道的关于ecDNA的功能有很多，例如为基因水平转移提供遗传物质以及维持生物膜的整体稳定性等。另外，对于ecDNA仍然还有很多的问题没有解决，例如ecDNA整合到生物膜中的分子机制，如何与基质中其他分子相互作用等，而且ecDNA的来源也仍然存在争论。Rosenbluh等人在M.xanthus细胞培养过程中利用同位素标记DNA的方法来检测细胞裂解，表明其胞外基质中可能含有ecDNA，但是目前还没有相关的研究进展。　　 与其复杂的生活周期相对应，M.xanthus基因组大小为9.14Mb，比大多数己测序δ分支细菌基因组大得多，共包含了7333个蛋白编码序列(CDS)。如此巨大的基因组除了来源于常见的基因倍增复制外，至少1.4Mb的部分是由基因水平转移(HGT)所产生的。而且，分析与子实体形成相关基因的进化史，发现其中22％的序列表现出了不同的密码子偏好性，这是HGT发生的另一个系统进化学方面的证据。自然条件下细菌间基因的水平转移方式，除了接合和转导外，还包括在革兰氏阴性及阳性菌中均广泛存在的转化现象。细菌可以通过自然转化的方式来获取和整合外源DNA，以实现细菌间的基因交换。在细菌的自然转化过程中存在诸多屏障，且在不同种群或菌株中，影响感受态形成的生长环境和调控因子也差别很大。因此，在研究某一特定菌株是否存在自然转化时，并没有通用的固定方法。虽然在变形细菌其他分支大多具有自然转化特性，但是之前还没有关于M.xanthus自然转化的报道。　　 围绕着胞外基质的多种生物学功能，本论文分别从三个方面对胞外基质与M.xanthus各种不同细胞行为间的关系进行了研究：一是胞外基质中ecDNA组分的特性及对细胞行为的影响，二是自然转化特性及其与胞外基质中EPS组分间的关系，三是EPS在液体生长条件下对细胞行为的作用。　　 在本文的第一部分中，我们对M.xanthus ecDNA的存在与分布、与EPS间的相互作用、对胞外基质稳定性的影响和来源等进行了表征。首先利用滤膜-小室分离系统及染色分析方法证实了ecDNA在胞外基质中的存在。以DK1622的生物膜和子实体为样品，用SYTO9和SYTOX orange对其做复染后用CLSM检测，发现ecDNA在胞外基质中并不是随机分布的，其在生物膜和子实体中分别形成了团状和网状结构。从相对位置和结合能力两个方面，分析了胞外基质的另一重要组分EPS和ecDNA之间的关系。将DK1622的生物膜和子实体用STYO9、STYOX orange和.Alexa633-WGA复染后观察，并对得到的图像进行共定位定量分析。结果表明，在M.xanthus生物膜和子实体中，ecDNA的染色信号大多与EPS的染色信号重叠在一起。同时，选择DK1622基因组和鲑鱼精子DNA两种不同的DNA，通过检测其在不同pH下与EPS的结合情况，发现DNA与EPS间确实有相互吸附作用，并且该相互作用不依赖于DNA的序列和大小，但却受pH的影响。ecDNA正是通过与EPS间的相互作用而粘附在M.xanthus的细胞表面。　　 研究了ecDNA对胞外基质稳定性的影响。向DK1622生物膜中添加DnaseⅠ后，发现其生物量减少了约20％，同时对SDS的抵抗力和机械强度均减弱了；且AFM的检测结果也表明经DnaseⅠ处理后的生物膜表面粘附力也比正常生物膜明显减弱。由此，推测ecDNA作为胞外基质的重要组分之一，在与胞外基质中的其他组分具有复杂的相互关联的同时，对维持胞外基质的机械强度和粘附力也具有非常重要的作用。　　 最后，在确定了ecDNA在胞外基质内的分布和生物学特性后，进一步研究了ecDNA的来源及其与生物膜内死细胞间的关系。将GFP表达突变株DK10547的生物膜和子实体用STYOX orange和细胞膜染料FM4-64复染后用CLSM检测，发现在早期生物膜和子实体中ecDNA的红色信号和死细胞之间并没有明显的重叠；另外，定量分析不同时间点的一系列图像信号后发现，在早期生物膜内ecDNA的浓度曲线是逐渐上升。这些结果均表明在M.xanthus中除了细胞自溶外，还存在其他产生ecDNA的途径。通过滤膜-小室方法提取ecDNA后，分别扩增在基因组上位置不同的七个基因，全阳性的扩增结果表明组成ecDNA的序列是无规则而没有特异性的。进而对各突变株的ecDNA产量做分析后，结果提示在M.xanthus中可能存在需能的ecDNA主动分泌过程，并且这一过程依赖于通道蛋白PilQ。　　 在本文的第二部分中，以pZJY41为供体DNA，尝试研究不同EPS突变株的自然转化能力，并在此基础上进一步探究影响自然转化发生的各种因素。根据EPS能够结合DNA的特性提出一个假设：EPS可能影响了M.xanthus潜在的自然转化。经过多种尝试，成功在EPS缺失突变株中实现了质粒的自然转化，但是同样条件下处理野生菌却没有得到转化子，这些结果提示EPS可能是抑制M.xanthus自然转化发生的胞外屏障。同时，所发现的M.xanthus能够在特定条件发生自然转化，是变形细菌δ分枝中的首例，从进化学方面支持此同源类群的进化祖先本身可能拥有自然转化的特性。　　 通过尝试各种不同类型供体DNA，发现只有以自主复制质粒pZJY41做供体时才能发生有效地自然转化，这可能是因为其自身能够在M.xanthus中独立复制，而不必如其他类型供体DNA需要与基因组整合后方可稳定存在。且来自M.xanthus的pZJY41比来自E.coli的效率要高约600倍，这表明M.xanthus的限制修饰体系可能是自然转化发生的另一胞内屏障。依次用实验证实了M.xanthus无细胞提取液(CFE)的核酸酶活性和基因组的甲基修饰特性。然后，将各种类型供体DNA做CFE甲基修饰化处理，结果修饰后的质粒表现出与基因组相似的甲基修饰特性，可以抵抗部分核酸酶的剪切，而且修饰后的定点整合质粒pSWU19和pZJY41具有比修饰前更高的转化效率。　　 以得到的具有最高转化效率的供受体条件为基础，研究了影响 M.xanthus自然转化过程的一些生理学特性。结果发现液体培养至稳定期后期的菌体具有最高的转化效率，即感受态细胞很可能在此阶段形成；该细胞与供体DNA在MMC固体上共培养时间为7 d时得到的效率最高，而在CYE上共培养则无转化子，说明了饥饿诱导条件及较长的培养时间是该自然转化过程所必需的。且SW810不能形成子实体，表明该转化过程与发育无关，但通过添加不同浓度的离子，发现Mg2+是其必需的。最后，通过检测UV照射和热处理后的转化效率，我们发现压力条件与感受态诱导之间没有明显的关联。　　 尽管对M.xanthus感受态形成的诱导和调控机理还不清楚，但是我们的结果表明部分TFP系统组分与DNA的转运吸收相关。首先，在分泌通道蛋白PilQ及其聚合所必需的Tgl蛋白缺失突变株中，自然转化被完全抑制了。其次，为PilA聚合提供能量的PilB，其缺失突变株的转化率明显降低了；对菌毛由细胞质膜向外延伸具有重要作用的膜蛋白PilC，其突变株的自然转化率是降低的。　　 在本文的第三部分中，研究了液体培养条件下EPS的合成对M.xanthus营养细胞生长、抗逆性及稳定期恢复生长的影响。首先，表征了各EPS相关突变株在液体培养基中的表型，发现EPS能够提高液体中细胞的存活能力，EPS+菌株在液体中培养12d后，仍有活细胞存在，而EPS-菌株在培养6d后，细胞就基本丧失了活性。EPS同时又是细胞聚集和形成菌团的关键因子，且EPS过量表达菌株产生的菌团更多，细胞凝集现象也约明显。其次，通过原位染色观察，发现液体培养基中形成的由EPS包裹的菌团，其结构与生物膜非常相似，代谢活性细胞均被包埋在EPS网络中。而且，菌团中的细胞在生理上也与生物膜中的细胞类似，对外界压力有一定的耐受性。再次，通过EPS缺陷菌株与EPS+菌株进行混合共培养实验，发现混合培养液中EPS缺陷菌株的细胞存活能力和抗逆性均有所增强。原位染色表明EPS-细胞可以整合到EPS+菌株的菌团内部，而被来EPS所保护。最后，菌团细胞恢复生长实验结果表明，虽然EPS过少不利于细胞长时间在液体中存活，而EPS过量也会对细胞生长产生反效果，抑制稳定期后细胞的恢复生长。EPS过量表达菌株的菌团表面形成了一层厚厚的基质，将细胞包裹在内部，细胞无法恢复生长。