小反刍兽疫(Pestedes petits ruminants,PPR)主要发生在发展中国家,严重危害养羊业的发展,其跨境传播能力强,致死率最高可达100%。我国目前报道的小反刍兽疫病毒(Pestedes petits ruminants virus,PPRV)流行毒株主要集中于西藏和新疆等养羊业比较集中的地区,其它地区的流行毒株少有报道。本研究对2014年从浙江富阳分离的一株PPRV流行毒株(FY株)进行了分离和鉴定,同时对其全基因组进行了测序和分析,以期为我国PPRV分子流行病学研究提供新的参考资料,并丰富PPRV基因库,这将有助于分析病毒变异状况,研究PPRV在我国的遗传背景等信息,选择适合的疫苗以及研发新型疫苗。本论文内容包括以下3个方面。1、PPRV FY株的分离和鉴定:将从浙江省富阳市采集的PPRV病料进行研磨,经离心、除菌后,分别接种于长满单层的Vero细胞、BHK细胞及CV细胞(CV)。培养96h后,收集细胞培养物,再在上述细胞中盲传3-5代。结果发现PPRV FY株在vero细胞和BHK细胞中均没有明显细胞病变出现,但是在CV细胞中出现典型细胞病变,主要表现为:细胞变圆、脱落、出现合胞体。待细胞出现80%左右病变时,收获细胞培养物,然后分别使用RT-PCR、Western Blot、间接免疫荧光及电镜负染等方法对病毒分离物进行鉴定。检测结果表明,从CV细胞培养物中能特异性地检测到PPRV的基因组,Western Blot、间接免疫荧光检测结果均证明用CV细胞分离到的病毒可与PPRV单抗F发生特异性反应。将收获的CV细胞培养物进行超速离心,纯化出病毒,然后用电子显微镜进行观察,可以看到具有囊膜的,直径在150-300nm之间的病毒颗粒,符合已报道的PPRV病毒颗粒形态学特征。上述研究结果证明,我们成功应用CV细胞分离到了PPRV,并将其命名为FY株。2、PPRV FY株N基因的原核表达及多抗的制备:扩增PPRV FY株N基因序列,连接到pET-32a载体上测序分析,测序正确后转化到(E.coli)BL21(DE3)菌株中,IPTG诱导,表达重组N蛋白,并采用包涵体纯化的方法纯化重组蛋白,将纯化蛋白免疫实验兔,制备多克隆抗体,并使用WesternBlot及间接免疫荧光等方法对得到的多抗进行鉴定,结果表明所制备多抗特异性良好并可用于PPRV的初步检测。3、PPRV FY株的全基因组序列测定及分析:根据已经发表的PPRV参考毒株序列,设计了 11对特异性扩增引物,然后用RT-PCR方法分段扩增出PPRV FY株的全基因组序列,应用DNAstar软件和MEGA软件对PPRV FY株及参考毒株的基因序列进行了比对和分析,并根据N基因核苷酸序列绘制了系统进化树。试验结果表明PPRVFY株基因组全长为15948nt,推测编码6种结构蛋白(N、P、L、M、F和H),2种非结构蛋白(C和V),PPRV各毒株转录起始序列和转录终止序列都高度保守。同源性比较分析结果显示,PPRVFY株与科特迪瓦来源毒株具有最低的同源性,然而与西藏来源毒株具有最高同源性,其基因间隔区N-P长度一致,相似度最高,而M-F相似度最低,通过比较PPRVFY株与参考毒株基因组末端调控序列,还可以看出在整个麻疹病毒属GP区和AGP区保守性较高,且存在不同程度的互补。氨基酸序列分析结果揭示PPRVFY株在保守区域出现21处氨基酸突变,这些突变对其所编码蛋白的结构和功能有何影响尚需要进一步研究。根据PPRV N基因序列,我们对PPRV FY株及参考毒株进行了系统进化分析。分析结果发现,PPRVFY株与其它亚洲源PPRV野毒株共同形成一个拓扑群,属于第IV谱系。综上所述,本研究成功分离到了 2014年流行于浙江省的PPRV流行毒株FY株,该毒株对细胞的适应性不强,仅能在表达其受体基因的细胞系中增殖。在此基础上,我们完成了对其全基因组序列的测定、N基因的原核表达及生物信息学分析,证明PPRVFY株属于基因IV型,并且与疫苗株的同源性较低,但与我国报道的其它野毒株具有较高同源性。