论文部分内容阅读
研究目的： 血-神经屏障（blood-nerve barrier,BNB）是存在于血液与周围神经系统(peripheralnervous system，PNS)之间的屏障系统，是一种功能性屏障，保护PNS。它是神经内膜微环境与细胞外隙或血液环境之间进行物质交换的动态接口，对物质转运和交换具备特殊的通透性和选择性，可以选择性通过亲水性物质如无机离子、蛋白质、多糖等。BNB通过调节神经内环境离子浓度和排泄代谢废物，维持PNS微环境的稳定。BNB由神经束膜和神经内膜血管组成。神经内膜血管是一种类似于血-脑屏障(blood-brainbarrier, BBB)的毛细血管，由外周神经微血管内皮细胞(peripheral nerve microvascularendothelial cells，PnMECs)紧密连接所组成;这些细胞被认为是血液和外周神经之间的真正接口，是BNB的结构基础。与组成BBB的内皮细胞相似，PnMECs也表达多种紧密接头缔合分子，如occludin、claudin-5等，这些分子组成紧密连接部，形成屏障特性。在病理情况下，BNB受损，通透性增加，有害物质进入神经内膜微环境，损害PNS，如免疫介导的神经病变发展的关键步骤是单核细胞的渗入和可溶性介质穿过微血管屏障的渗透等，并且存在PnMECs损伤，细胞间的紧密接头蛋白表达降低，细胞屏障性减弱。 目前，临床有许多药物都有周围神经毒性，尤其是肿瘤化疗药物，影响了患者对治疗方案的依从性，降低了他们的生活质量。但是，我们对其产生机制了解的并不清楚。我们通过查阅文献发现近年来对于药物周围神经毒性机制的研究侧重于药物直接损伤PNS，而忽略了保护PNS的屏障-BNB在此过程中可能起到的作用。于是我们使用奥沙利铂作为工具药，建立周围神经毒性模型，并设计了一系列实验来研究BNB在药物周围神经毒性过程中的作用。 研究方法: 第一部分:大鼠周围神经毒性模型的行为学、电生理学评估。大鼠尾静脉注射1mg/kg的奥沙利铂，建立周围神经毒性模型。通过Von Frey纤维丝压力刺激实验、冷板实验、热板实验来验证奥沙利铂周围神经毒性模型的可靠性。测定大鼠的神经传导速率来评估奥沙利铂对PNS的损伤程度。另外，为了排除奥沙利铂潜在肾毒性的干扰，取大鼠肾脏组织，进行免疫组化实验。 第二部分:奥沙利铂给药后，背根神经节、坐骨神经改变情况。通过透射电镜技术检测给药后背根神经节、坐骨神经的形态和结构的改变情况，并通过代谢组学分析奥沙利铂周围神经毒性早期背根神经节、坐骨神经的差异代谢物。 第三部分:奥沙利铂对BNB影响的检测及原代PnMECs体外培养。伊文思兰是常见的BBB指示剂，正常情况下不能通过BBB。通过伊文思兰染色实验来检测奥沙利铂周围神经毒性过程中BNB结构的完整性。PnMECs是BNB的结构基础，是体外研究BNB的常用细胞。以大鼠坐骨神经为原材料，提取、培养原代PnMECs。内皮细胞能特异性摄取Dil-Ac-LDL;而FactorⅧ是一种内皮细胞的特异性标记物，故选择二者来鉴定所提PnMECs的内皮特性。通过反转录PCR实验技术检测PnMECs内紧密连接蛋白claudin-5和ZO-1、转运蛋白GLUT-1和Mdr1a的mRNA表达情况，确定所提细胞的屏障特性。 研究结果: 第一部分:在Von Frey纤维丝压力刺激试验中，给药4次后，大鼠表现出明显的压力敏感性神经异常疼痛;冷板实验中，从第4次给药开始，无伤害的冷刺激引发大鼠产生明显的温度敏感性神经异常疼痛;热板实验中，伤害性热刺激未能引发受试大鼠产生明显的热敏感神经过敏性疼痛。奥沙利铂给药4次后，受试大鼠神经传导速率发生了大幅度降低。连续给药10次后，给药组大鼠肾脏组织中的远曲小管、近曲小管和肾小体的组织形态，与对照组大鼠相比未发生明显改变。 第二部分:给药4次后，大鼠背根神经节神经元及坐骨神经组织中的神经纤维都出现受损情况，并随给药周期的增加，受损加重。但是，给药2次后的实验组大鼠坐骨神经组织中的神经纤维已经开始出现轻微的脱髓鞘，而此时背根神经节神经元的形态、结构与对照组没有明显区别。通过代谢组学，筛选出背根神经节组织给药前后表达差异代谢物24种，坐骨神经给药前后表达差异代谢物13种，二者所涉及的差异代谢物不尽相同。 第三部分:伊文思兰染色实验表明在对照组大鼠和给药1次的实验组大鼠坐骨神经组织中，伊文思兰的红色荧光仅局限于神经内膜血管中。在第2次给药后，坐骨神经组织中弥散强烈的红色荧光，BNB的通透性增加。以大鼠坐骨神经为原材料，提取、培养了原代PnMECs。所提细胞能摄取Dil-Ac-LDL，表达FactorⅧ。并且在细胞内检测到了紧密连接蛋白claudin-5和ZO-1、转运蛋白GLUT-1和Mdr1a的mRNA表达，所提细胞具有屏障特性。 研究结论: 大鼠尾静脉注射奥沙利铂，早期虽然尚未出现行为学和电生理学方面的改变，背根神经节组织也未发生变化，但是坐骨神经BNB受损，通透性增加，神经纤维出现轻微脱髓鞘。本课题将BNB这一概念引入化疗药物周围神经毒性机制研究中，提出在化疗药物周围神经毒性早期药物先作用于BNB，引起BNB形态、功能改变，进而影响PNS实质，而不是化疗药物直接损伤周围神经组织。为研究化疗药物导致周围神经毒性机制提供新的思路，为临床上发现有效的预防和治疗化疗药物周围神经毒性的策略奠定理论依据。