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本试验通过控制2,4-D浓度与生长发育时间来进行龙眼胚性愈伤组织体胚发生同步化调控;测定了各个阶段关键的生物大分子的动态变化;检测了与龙眼体胚发生有密切关系的抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性,并且研究了在不同温度下APX活性的变化;进而以龙眼胚性愈伤组织为材料,提取RNA,进行胞浆型APX基因同源克隆,以探讨APX在植物体胚发生中的作用机制,为揭示植物体胚发生的分子机制提供新的线索。主要研究结果如下: 1 龙眼体胚发生的同步化调控及其生物大分子的动态变化 通过控制2,4-D浓度与生长发育时间,获得龙眼胚性愈伤组织体胚发生各个发育阶段的高度同步化体胚材料。 淀粉主要有两个累积峰值。第1次在胚性愈伤组织时期,第2次是到球形胚时,在鱼雷形胚又有一个小回升。这时淀粉积累较心形胚和子叶形胚高一些。随着胚胎的发育,DNA、RNA、总核酸的变化趋势大致相同,最高点均出现在心形胚,其中RNA的变化较DNA、总核酸明显,蛋白质的变化近似呈现“S”形。这些生物大分子的动态变化对于体胚的发生和发育起着重要作用。 2 龙眼体胚发生过程中APX活性的变化 龙眼体胚各个阶段的同步化材料都检测到了APX的活性,并且在子叶形胚时的酶活性最高,此酶活应该是可溶性的APX的多种同工酶活性的总和。APX的表达和其酶活性变化检测的结果并不一致,因而APX的活性增加不能简单看作是基因表达量的增加。龙眼APX的活性可能是由两种方式调控:通过蛋白质-蛋白质相互作用;通过转录和转录后调节。 采用龙眼早期胚胎发育的典型阶段愈伤组织、球形胚、子叶形胚的同步化材料,在20℃、25℃、30℃下培养3天,然后检测APX活性。结果表明:愈伤组织、球形胚、子叶形胚,在20℃、25℃、30℃下均检测到了APX活性。经20℃、30℃处理的胚性培养物APX活性与常温(25℃)下的酶活性比较,发现20℃下的酶活与25℃下的酶活差异不是很明显,25℃下酶活略高与20℃下的酶活,30℃下的酶活大约是20℃下的酶活的1.5倍。一定温度范围下,高温可以诱导APX表达。热胁迫诱导细胞有关的抗氧化途径的保护机制。这种诱导对于不同的同工酶具有差异性。龙眼早期体胚在正常温度下检测到了APX的mRNA,而且也检测到了酶活性,说明在龙眼体胚的