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目的:人细胞色素P450（CYP450）在肝脏中是含有亚铁血红素蛋白的超基因家族。参与大部分药物的代谢过程,也被称为混合功能氧化酶或单加氧酶。CYP3A被认为是人类P450家族在某些器官中最主要的功能形式。约占肝脏中总P450含量的30%,参与45%-60%常用药物在体内的代谢转化过程,包括氧化、过氧化或者还原等。CYP3A4和CYP3A5是肝脏和肠道中主要的CYP3A功能形式,代谢大部分相同的底物,但具有不同的代谢常数。而且由于这两者在个体中含量的不同,因此可能具有不同的药物代谢能力。CYP3A4亚家族中由于基因、年龄、疾病状态等因素,酶活性之间具有明显的个体差异,不仅表现在肝脏表达水平差异约40倍,且个体对药物的体内代谢能力也相差10倍左右。其中,基因因素的作用约占60%-90%。目前,发现许多CYP3A4等位基因可能是造成个体间药物代谢差异的一个重要因素。实验目的是:通过体外的对比研究,找出CYP450 3A的CYP3A5*1A（w]r）（野生型）和CYP3A4*1A（WT）和CYP3A4*3（M445T）,*4（I118V）,*17（F189S）,*18（L293P）等位基因在药物代谢和药物抑制中的差异,分析其差异性存在的原因。方法:在已有的CYP3A4和CYP3A5的野生型模板情况下,利用不对称PCR的方法在CYP3A4野生型基因中引入各等位基因的突变位点,利用酶KpnⅠ和XhoⅠ消化产生插入片段,与含有同样酶切位点的大肠杆菌pYES2/CT载体进行连接,然后转化到大肠杆菌中。通过氨苄青霉素抗性标记筛选出重组子,初步鉴定后,再通过测序确认,无非同义突变后,转化入整合有POR基因的酵母菌株中,利用半乳糖诱导重组子在酵母系统中进行表达,差速离心法制备得到微粒体。并用CYP3A的特异性反应:荧光底物DBF（Dibenzylfluorescein）的去甲基化和硝苯地平的氧化,进行酶动力学的分析,非线性回归分析法计算出Km值和Vmax值,进而得到体外代谢的内在清除率CLint,以此为依据比较各重组酶的代谢差异。与此同时,使用原生型和各突变株微粒体蛋白在两种检测系统中分别对19种和6种药物进行筛选,求出其IC50值,研究药物抑制的相互作用。结果:酿酒酵母表达体系是CYP450酶系理想的体外表达体系。体外酶动力学和药。物抑制的对比研究中发现:除CYP3A4*17等位基因酶外,3A5-WT,3A4-WT,和CYP3A4*3,*4,*18均能将DBF和硝苯地平代谢成相应的产物,*17号由于活性几乎丧失因此也无法进行后续的药物抑制实验。在CYP3A4和CYP3A5的对比研究中发现:3A5-WT对DBF和硝苯地平的亲和力较3A4-WT的低（Km分别是后者的2.0和3.0倍）。3A5-WT对两种底物的CLint分别比3A4-WT降低了2倍和3倍（p<0.05,n≥3）。在两种底物的抑制实验中,两株野生型均能被酮康唑强烈的抑制,但是对CYP3A5-WT的抑制没有3A4-WT的强,对前者的IC50值分别是0.012和0.036μM,对后者的IC50值分别是0.040和0.049μM。另外18种药物除了那些对两者都不存在抑制的药物外,平均而言大部分药物对3A5-WT的IC50是对3A4-WT的4倍。在3A4-WT与其等位基因的对比研究中:各等位基因对DBF的亲和力与WT相当（Km相近）,*3和*18的CLint分别是WT的3.1和3.8倍（p<0.05）,*4仅是WT的1.3倍（p=0.1010）。各等位基因对硝苯地平的亲和力均比WT低（Km依次分别是WT的1.6、2.0和1.3倍）,*4和*18的CLint分别是WT的0.7和2.6倍（p<0.05）,*3与WT相当（p=0.7676）。以DBF为底物时,药物对WT和各等位基因的抑制程度排序为:酮康唑>地尔硫卓>曲格列酮>舍曲林>维拉帕米>氟西汀>大扶康>奥美拉唑>红霉素>来适可>文迪亚>泰洛平>普拉固=立普陀=华法林=万络=辛伐他汀=西咪替汀。药物对WT和各等位基因酶的抑制程度的排序为:*3>*18>WT>*4。以硝苯地平为底物时,药物对WT和各等位基因的抑制程度排序为:酮康唑>地尔硫卓>维拉帕米>大扶康>西乐葆>万络,六种药对WT和各等位基因酶的抑制程度的排序为:WT>*18>*3>*4。针对某种药物的具体抑制情况,3A4多态性现象依然存在,且存在明显的底物依赖现象。氨基酸顺序不同或者改变后,酶动力学特征发生明显改变,且对药物抑制的程度也发生了一定变化。结论:等位基因和WT相比,氨基酸改变后,酶动力学特征与野生型有明显差异,且对药物抑制的程度也发生了改变。此外,本实验成功构建了在酵母表达系统中高效表达CYP3A重组酶的方法,表达出的重组酶具有活性高、稳定性好等特点。同时也建立起荧光和HPLC两种针对于CYP3A4遗传多态性研究的药物筛选平台,为进一步研究CYP450的研究奠定了良好的基础,除可以作为一种新药临床前高通量筛选的方法外,而且也有助于推动临床个体化用药的发展。