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第一部分目的构建leftyl基因与pcDNA3.1(+)相融合的重组质粒,在leftyl基因的下游加上flag标签,并探讨重组质粒在体内外能否有效表达。方法设计并合成leftyl基因上下游引物,同时加上flag标签序列,PCR扩增基因,并将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,双酶切图谱分析和扩增产物测序鉴定所构建的真核表达载体。脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-leftyl-flag转染至肾小管上皮细胞株HK-2,免疫印迹检测lefty1、 flag蛋白的表达。通过流体力学的方法将leftyl基因转至输尿管梗阻的小鼠体内,mRNA和蛋白水平检测leftyl,蛋白水平检测flag在小鼠肝脏和肾脏的表达,ELISA检测血循环中leftyl蛋白的水平。结果以leftyl基因质粒模板扩增得到的片段约1150bp,双酶切得到目的基因片段,将目的基因片段与pcDNA3.1(+)连接,双酶切分析及测序显示与leftyl基因序列相同。肾小管上皮细胞质粒转染后,pcDNA3.1(+)-lefty1-flag较pcDNA3.1(+)转染的肾小管上皮细胞leftyl表达水平上调,仅pcDNA3.1(+)-lefty1-flag转染组表达flag蛋白。小鼠体内基因转移后,pcDNA3.1(+)-lefty1-flag较pcDNA3.1(+)转染组肾脏和肝脏中leftyl表达水平升高明显,仅pcDN A3.1(+)-lefty1-flag转染组在肝脏和肾脏表达flag蛋白。ELISA法检测了循环中leftyl蛋白含量显示pcDNA3.1(+)-lefty1-flag较pcDNA3.1(+)转染组血液中leftyl蛋白含量明显增加。结论成功构建leftyl基因真核表达载体,在肾小管上皮细胞和小鼠体内pcDNA3.1(+)-lefty1-flag能成功转染真核细胞并表达leftyl蛋白。第二部分目的研究leftyl蛋白对肾小管损伤和间质纤维化的影响,并探讨可能机制。方法建立左侧输尿管完全梗阻肾损伤模型,通过流体力学的方法将pcDNA3.1(+)和pcDN A3.1(+)-lefty1-flag转至小鼠体内。HE染色和PAS染色检测leftyl蛋白对肾小管损伤的影响。肾脏PSR染色、qPCR和免疫组化检测胶原Ⅰ和纤维粘粘蛋白以检测leftyl蛋白对肾脏间质纤维沉积的影响。免疫组化和免疫印迹检测leftyl蛋白对肾小管上皮间质转化相关分子E-cadherin和a-SMA的影响。免疫印迹检测leftyl蛋白对肾脏TGF-pl和p-Smad3的影响。结果输尿管梗阻+pcDNA3.1(+)处理组肾小管损伤评分为2.244±0.72,PSR染色间质纤维面积百分比为12.58±1.98%,胶原Ⅰ和纤维粘粘蛋白相对表达量分别为6.44±1.57、8.59±2.10, E-cadherin和a-SMA的相对表达量分别为0.16±0.05、1.23±0.16, TGF-β1和p-Smad3的相对表达量分别为1.26±0.15、1.23±0.09,以上个各指标与假手术组相比P<0.05。而输尿管梗阻+pcDNA3.1(+)-lefty1-flag处理组肾小管损伤评分为1.42±0.61,PSR染色间质纤维面积百分比为7.17±1.20%,胶原Ⅰ和纤维粘粘蛋白相对表达量分别为3.53±0.95、4.04±2.08,E-cadherin和α-SMA的相对表达量分别为0.52±0.11、0.72±0.27,TGF-β1和p-Smad3的相对表达量分别为0.68±0.10、0.74±0.16,以上各指标与输尿管梗阻+pcDNA3.1(+)处理组相比P<0.05。结论Leftyl能拮抗输尿管梗阻引起的肾小管损伤和间质纤维化。其效果可能是由其抑制smad依赖性的TGF-β1信号通路所介导。第三部分目的研究leftyl蛋白的对肾脏小管间质炎症的影响,并探讨可能机制。方法建立左侧输尿管完全梗阻肾损伤模型,通过流体力学的方法将pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-lefty1-flag转移至小鼠体内。免疫组化检测肾间质巨噬细胞和T淋巴细胞。免疫组化检测p65的核转位。免疫印迹检测p-p65、趋化因子CCL2和CCL5、细胞因子TNF-α和IL-1β的表达。结果输尿管梗阻+pcDNA3.1(+)处理组肾间质巨噬细胞和T淋巴细胞细胞数分别为23.90±6.31/视野、10.20±3.20/视野,肾脏p-p65阳性细胞数为52.40±11.27/视野,p-p65的相对表达量为0.13±0.04, CCL2和CCL5相对表达量分别为1.23±0.18、0.80±0.12, TNF-α和IL-1β相对表达量分别为1.17±0.10、1.21±0.11,以上个各指标与假手术组相比P<0.05。而输尿管梗阻+pcDN A3.1(+)-lefty1-flag处理组肾脏间质巨噬细胞和T淋巴细胞细胞数分别为8.50±3.50/视野、5.50±1.90/视野,肾脏p-p65阳性细胞数为23.80±4.78/视野,p-p65的相对表达量为0.08±0.02,CCL2和CCL5相对表达量分别为0.64±0.17、0.23±0.06,TNF-α和IL-1β相对表达量分别为0.64±0.10、0.68±0.12,各指标与输尿管梗阻-pcDNA3.1(+)处理组相比P<0.05。结论leftyl蛋白能拮抗输尿管梗阻引起的肾脏小管间质炎症,其机制可能与其抑制肾间质巨噬细胞和T淋巴细胞浸润有关。