论文部分内容阅读
恶性肿瘤发病率逐年上升,新的治疗方法和治疗手段不断涌现,近来药物靶向载体在肿瘤治疗中成为一个新的热点。部分肿瘤患者借助于药物靶向载体治疗的方法提升了生存质量,延长了生存期。抗癌药物偶联药物输送载体,进行药物的靶向输送,成为了一个很好的研究方向。抗癌药物顺铂(cis-Dichlorodiamineplatinum, CDDP)是临床上使用多年的广谱抗癌药物,但是顺铂会抑制骨髓新生,具严重的肾毒性和胃肠道反应,这些缺陷限制了其临床应用。利用高分子聚合物作为抗肿瘤药物载体的研究目前已成为热点。具有纳米尺度的高分子聚合物载体能在肿瘤组织中高度聚集(enhanced permeability and retention effect, EPR effects)。偶联了药物的高分子聚合物载体有良好的缓释效果,使药物在体内的代谢半衰期延长。在高分子聚合物载体上进行一些靶向配体的修饰还可以实现药物的主动靶向效果。文献显示转铁蛋白受体在肿瘤组织内高度表达,由噬菌体展示技术得到的多肽P8(C-HAIYPRH)与转铁蛋白受体(transferrin receptor, TfR)具有高度亲和力。基于以上研究背景,我们利用实验室前期制备的聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid, γ-PGA)-天冬氨酸(Asp)-马来酰亚胺(Mal)(PGA-Asp-Mal, PAM)药物载体与P8偶联,制备靶向药物载体,连接肿瘤临床一线药物顺铂,形成具主动靶向的肿瘤治疗药物PGA-Asp-Mal-P8-CDDP (PAMPC).整个研究内容和结果包括以下三个方面：(1) PAMPC的制备和结构表征利用高温酸解法降解生物发酵的大分子γ-PGA,获得小分子γ-PGA,利用酰胺化反应偶联天冬氨酸制备得到PGA-Asp (PA)复合物。PA与带有氨基的六碳马来酰亚胺(NH2-6C-Mal)接头分子经过酰胺化反应得到PGA-Asp-Mal(PAM)复合物,该复合物装载CDDP后得到PGA-Asp-Mal-CDDP (PAMC)复合物,最后PAMC与转铁蛋白受体高度亲和的靶向肽P8再结合形成具有主动靶向的抗肿瘤药物PAMPC。PAMPC经透射电镜、原子力显微镜及纳米粒度仪检测,其大小依次为89±28nm,98+25nm,89±18nm,表明制备得到具纳米尺度的肿瘤靶向药物输送系统PAMPC,其能通过EPR效应在肿瘤组织中高度富集。在生理盐水中进行的PAMPC缓释实验(t1/2=23h)与游离顺铂(t1/2=1.5h)相比,PAMPC具备良好的缓释能力。(2) PAMPC的体外生物学试验PAMPC的体外生物学试验包括体外细胞靶向验证和细胞毒性实验。选择TfR高表达的肿瘤细胞株,以子宫颈癌HeLa和肝癌SMMC-7721细胞作为研究对象,在荧光显微镜下能够观察到药物载体PAMP对HeLa和SMMC-7721细胞特异性结合,流式细胞术进一步证明PAMP对这两种细胞有高亲和力,且对HeLa细胞的靶向作用略优于SMMC-7721细胞(平均荧光强度分别为99.7和83.57). PAMPC药物和游离顺铂与HeLa、SMMC-7721细胞分别进行24h和48h的孵育,MTT结果表明PAMPC对两种肿瘤细胞的毒性具有药物浓度依赖性。PAMPC药物和游离顺铂与HeLa. SMMC-7721细胞进行短时孵育10min,除去药物,然后换新的培养基继续培养24h和48h。MTT结果显示PAMPC药物与细胞孵育24h后,对HeLa细胞的IC50(217.3±79.5μg/ml)和SMMC-7721细胞的ICso (120.1±17.3μg/ml)均比游离顺铂组更低,证实PAMPC药物的主动靶向对靶标细胞毒性有显著的促进作用,具有良好的主动靶向杀伤效果。(3) PAMPC的体内生物学试验PAMPC的体内生物学试验通过对昆明鼠体内毒性试验和荷HeLa肿瘤裸鼠来验证。昆明鼠急性毒性试验中,PBS对照组,PAMP载体组和PAMPC药物组的动物体重分别增加了61%,60%和59%,动物存活率为100%,而游离顺铂组的动物体重下降了17%,动物存活率仅为50%。游离顺铂组对比其它组出现极显著的肝脏毒性(谷草转氨酶AST, P＜0.001;谷丙转氨酶ALT, P＜0.001)和显著的肾脏毒性(肌酐CREAP,P<0.01;尿素氮Urea, P＜0.001).在荷HeLa肿瘤裸鼠实验中,PAMPC组比游离顺铂组能够更加显著地抑制肿瘤生长(p<0.01,且肝肾毒性降低,动物存活率为100%。尾静脉注射PAMPC (200μ1多肽浓度50μg/ml),24h后荧光显微镜下观察组织切片,发现肿瘤组织内荧光强度是其他组织的5-10倍。无关肽P8X也可以在各个组织中检测到荧光强度,但在肿瘤组织中没有发现荧光强度明显增强,提示在靶标肿瘤中的药物浓度显著提高。综上,PAMP药物载体对TfR高表达的肿瘤具有良好的被动和主动双重靶向效果,连接顺铂制备的肿瘤药物PAMPC能够显著提高顺铂的疗效、降低顺铂的毒性,提示基于聚谷氨酸的主动靶向药物载体PAMP具有良好的转铁蛋白受体亲和力,PAMPC药物输送系统有希望成为新型的肿瘤靶向治疗药物。