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由于传统的手术、化疗和放疗的局限性,肿瘤治疗迫切需要新的手段、开辟新的途径。近年来,随着分子生物学、细胞生物学及生物技术的迅猛发展,推动了整个医学领域中生物治疗学的发展,肿瘤生物治疗越来越受到人们的广泛关注,其中的细胞过继免疫治疗成为近年来研究的热点。过继免疫治疗最关键的是选择理想的效应细胞,从上世纪八十年代发现LAK细胞以来,先后有TIL、A-LAK、CTL、TAK、CIK细胞被发现并应用于临床试验,但都存在着各自不同的缺陷和不足。我们探索并研究了新的肿瘤过继免疫效应细胞—PHA-CD3AK细胞,这一新的效应细胞在增殖倍数、杀伤活性、体外存活时间等各方面均优于其他效应细胞。本研究对其生物学特性及临床应用进行了初步研究。主要内容有:1、PHA-CD3AK细胞的制备及其生物学特性初步研究目的:研究PHA-CD3AK细胞的体外诱导方法及其生物学特性,并与LAK细胞进行比较。方法:分离人外周血单个核细胞(PBMC),采用植物血凝素(PHA)、单克隆抗体(anti-CD3McAb)和基因重组人白细胞介素2(rhIL-2)、共同诱导制备PHA-CD3AK细胞;应用流式法分析PHA-CD3AK细胞的免疫表型、乳酸脱氢酶法(LDH)检测PHA-CD3AK细胞的杀伤活性,并观察其形态;吉姆萨染色法观察其核型。结果:微量的anti-CD3McAb(0.05ug/m1)辅以少量的rhIL-2(300u/m1)和PHA(100ug/mL)共同培养,即能诱导和大量扩增PHA-CD3AK细胞,其扩增倍数显著高于LAK细胞,维持高扩增的时间也远较LAK细胞持久;当效靶细胞比为80:1时, PHA-CD3AK细胞对体外肿瘤细胞(K562)杀伤的百分率为56.5%;免疫表型检测PHA-CD3AK细胞中CD3~+、CD4~+、CD8~+细胞的比率分别为(86.5±5.89)%、(38.20±5.27)%、(42.63±3.50)%;核型为正常二倍体,染色体数目为46条。结论: PHA-CD3AK细胞是以CD3~+、CD4~+、CD8~+细胞为主的异质细胞群,并具有淋巴母细胞样特征,PHA-CD3AK细胞为正常二倍体细胞。PHA-CD3AK细胞是易于体外诱导、扩增能力强,体外存活时间长、杀瘤活性高的一种具有广阔应用前景的肿瘤过继免疫效应细胞。2、PHA-CD3AK细胞过继免疫治疗中晚期恶性肿瘤的初步临床研究目的:观察抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(anti-CD3 monoclonal antibody activated killer cell, PHA-CD3AK)过继免疫治疗中晚期恶性肿瘤的疗效。方法:从51例恶性肿瘤患者自体外周血分离单个核细胞,加入PHA、anti-CD3mAb、重组人IL-2 (rhIL-2)体外诱导后扩增培养,制备自体PHA-CD3AK细胞。待细胞培养至第12 ~ 14天时取样用于质控检测,收集质控检测合格的PHA-CD3AK细胞,调整至终浓度为(4.0 ~ 6.0)×10~9/L,静脉回输至患者体内,每例患者治疗3个疗程,每疗程回输5次(每2 d回输1次),每次回输细胞数不低于1×10~9,每疗程回输细胞总数大于5×10~9。应用人T细胞亚群检测试剂盒和流式细胞仪测定治疗前后患者外周血CD3~+、CD4~+、CD8~+T细胞以及CD16~+56~+细胞(NK细胞)比例;观察治疗前后患者的相关化检指标、生活质量以及不良反应;评定疗效,计算有效率和临床受益率。结果:分离制备的PHA-CD3AK细胞符合活性细胞质控要求,可用于进一步实验治疗。PHA-CD3AK细胞过继免疫治疗后,患者外周血CD3~+、CD4~+、CD8~+ T细胞以及CD16~+56~+细胞(NK细胞)比例分别为(48.88±9.42)%、(35.09±4.11)%、(28.17±4.97)%、(20.31±6.98)%,较治疗前均显著升高(均P < 0.05)。51例患者中,45例患者治疗后全身症状改善明显;所有患者治疗后相关化验指标均未出现异常变化,也未出现其他全身毒副反应;其中完全缓解6例、部分缓解14例、微效10例、稳定12例、进展9例,总有效率达58.8%,临床受益率达82.4%。结论:PHA-CD3AK细胞过继免疫治疗恶性肿瘤疗效确切,并能有效改善和提高患者的机体免疫功能,而且安全,无副作用。本研究对PHA-CD3AK细胞的体外诱导制备以及生物学特性和体内临床应用进行了系统的初步研究,为进一步临床推广应用提供了重要的实验依据和有益的探索。初步表明PHA-CD3AK细胞是一种安全、有效,具有广阔应用前景的抗肿瘤过继免疫效应细胞。