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目的：研究口蹄疫病毒(FMDV)VP2基因在宿主细胞中的功能,表达后对细胞凋亡的作用以及与VP2结合的蛋白的确定。
方法：以全长的FMDV cDNA为模板,利用PCR获得含有特定酶切位点的VP2基因,经限制性内切酶消化后,通过T4 DNA连接酶连接到表达载体pIRES2-EGFP及pET42a上,再转化到大肠杆菌,进行抗性筛选单克隆菌株;经序列测定确认正确后,将pIRES2-EGFP-VP2重组表达质粒转染293细胞进行瞬时表达,然后利用Western:Blot检测VP2基因的表达情况;若瞬时表达结果为阳性,再将pIRES2-EGFP-VP2重组表达质粒稳定转染BHK-21细胞,经绿色荧光及抗性筛选、克隆及Western Blot检测后,获得表达VP2基因的稳定细胞系。通过药物处理后,对表达及不表达VP2的细胞进行细胞凋亡的比较,包括Caspase3活性、PARP活性及DNA片断化的检测。对pET42a-VP2进行序列测定确认正确后,对含pET42a-VP2的大肠杆菌进行诱导表达,经SDS PAGE分析确认表达后,纯化pET42a-VP2融合蛋白,再与BHK-21细胞进行GST Pull down实验,检测VP2蛋白与宿主细胞蛋白的结合情况。
结果： FMDV VP2基因真核重组表达载体pIRES2-EGFP-VP2测序结果经比对正确;FMDV VP2基因在真核细胞中能够表达,并构建了稳定表达FMDV VP2的细胞系;初步实验结果显示FMDV VP2基因对细胞凋亡有促进作用。FMDVVP2基因原核重组表达载体pET42a-VP2测序结果经比对正确;FMDV VP2基因在原核细胞中能够表达,纯化的融合蛋白与BHK21细胞进行GST Pull down实验后,发现VP2与宿主细胞蛋白结合。
结论：本实验成功构建了FMDV VP2基因的真核重组表达载体;FMDV VP2基因表达载体在宿主细胞中能够表达;成功建立了表达VP2基因的稳定细胞系;初步实验结果显示FMDV VP2基因在细胞凋亡中可能起促进作用;本实验还成功构建了原核重组表达载体并得到了表达,可通过纯化用于研究与VP2基因相互作用的宿主细胞蛋白。