论文部分内容阅读
白斑综合征病毒(white spot syndrome, WSSV)是引起养殖对虾大规模死亡主要病毒性病原。本文定位了WSSV的4种粘附蛋白,并得到与粘附蛋白之一VP37相互作用的对虾细胞膜53 kDa蛋白,为进一步阐明WSSV致病的分子机理提供理论基础。本文首先通过地高辛(DIG)标记的WSSV与中国明对虾原代培养的多种细胞(心脏、类淋巴器官、造血组织、血细胞等)存在特异性的结合作用,证实了对虾细胞上存在WSSV的受体。再用地高辛标记的对虾血细胞膜和鳃细胞膜蛋白与印迹到硝酸纤维素膜上,通过SDS-PAGE分离的病毒蛋白结合,定位了WSSV的4种粘附蛋白,分别为:37 kDa,39 kDa,和高于97 kDa的2个蛋白。通过质谱分析获知VP 37是wsv254编码的蛋白。根据毕赤酵母的嗜性对粘附蛋白vp37基因改造后人工合成,在毕赤酵母中成功表达得到有活性的重组目的蛋白rVP37。并通过Ni2+亲和层析的作用,得到与VP37相互作用的53 kDa对虾鳃细胞膜蛋白。这一结果与2% Tween-20处理WSSV,其组份分别经过离子交换层析和凝胶过滤层析及ELISA活性验证,确定53 kDa对虾膜蛋白具有结合活性的结果相符。质谱分析推测该蛋白与ATP synthase beta subunit (Drosophila melanogaster)有较高的同源性。洗脱回收粘附蛋白之一VP 37,免疫兔子制备抗血清,能与VP 37特异性结合,同时在较高分子量范围的病毒蛋白和VP 37在抗原性上没有相似性。对VP37含有“R G D”结合结构域的9个氨基酸功能小肽(L I Q E R G D E I)人工合成后验证活性,发现“R G D”对结合活性起重要作用,但不代表VP37结合活性的全部。VP 28是WSSV囊膜的主要结构蛋白之一,本文使用表面活性剂处理得到的电泳纯VP 28,并ELISA实验验证其结合活性。结果显示VP 28不能与对虾鳃膜蛋白结合。选取凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的4种组织(鳃、血淋巴、肝胰腺、肌肉),着重对膜蛋白的提取方法及其多肽组成进行了初步分析。确定了这几种