CRISPR/Cas9介导的自发性高胆固醇血症兔模型的建立

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目的:为了研究自发性高胆固醇血症和动脉粥样硬化性疾病,针对兔LDLR和ApoE基因,使用CRISPR/Cas9基因编辑工具制备低密度脂蛋白受体(LDL receptor,LDLR)和/或载脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE)基因缺失的自发性高胆固醇血症兔模型。方法:本研究使用CRISPR/Cas9系统,分别针对兔LDLR基因第2外显子设计1对sgRNA(sgRNA1、sgRNA2)和第7外显子设计1对sgRNA(sgRNA3、sgRNA4),以及针对ApoE基因第1外显子设计1对sgRNA(sgRNA5、sgRNA6)。将经过体外转录获得的Cas9 mRNA和不同的sgRNA分组显微注射至不同受精卵的细胞质内,分组如下:①Cas9mRNA和 sgRNA1、sgRNA3、sgRNA6;②Cas9mRNA 和 sgRNA2、sgRNA4、sgRNA5;③Cas9mRNA和sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4;④Cas9mRNA和sgRNA5、sgRNA6。将注射好的受精卵胚胎移植至受体中,代孕,获得原代兔。对原代兔进行基因型鉴定、编码氨基酸和蛋白结构模拟分析、脱靶现象分析,确定其基因型。将经鉴定发生基因突变的原代兔,置于正常饮食环境中,于12周龄时,耳缘静脉采血检测其血脂浓度、Western blot检测其血浆载脂蛋白 B(Apolipoprotein B,ApoB)、ApoE 和载脂蛋白 AI(Apolipoprotein AI,Apo AI)含量、1%琼脂糖凝胶电泳和快速液相层析(FPLC)分析血浆脂蛋白分类和含量,以确定是否发生自发性高胆固醇血症。36周后,剖取主动脉,给予苏丹IV染色、病变组织HE染色、Masson三色染色和免疫组织化学染色,观察分析是否发生动脉粥样硬化。通过以上分析,确定自发性高胆固醇血症模型是否建立。结果:通过CRISPR/Cas9系统基因编辑工具,最终获得13只原代突变兔。包括LDLR单敲除(LDLR-/-)兔、LDLR基因大片段缺失兔、ApoE单敲除(ApoE-/-)兔和LDLR/ApoE双敲除兔。其基因突变多样,包含插入突变、缺失突变、替换突变、移码突变等,并且在所预测的范围内没有发生脱靶现象。蛋白结构模拟预测,发现其突变基因所编码的蛋白均发生了不同程度的结构或功能异常。对LDLR-/-兔和LDLR/ApoE双敲除兔血浆脂质浓度检测,结果发现在正常饮食状态下发生血浆胆固醇浓度升高,总胆固醇浓度最高可达正常的18倍,低密度脂蛋白胆固醇浓度更是高达正常的40倍。Western blot结果显示,突变兔血浆中ApoB和ApoE(ApoE基因敲除兔除外)含量也随之升高,ApoAI含量降低,表明血浆中残余脂质升高。36周后,突变兔主动脉染色显示,动脉表面出现动脉粥样硬化斑块附着,斑块覆盖率最高达92%,且出现动脉粥样硬化典型病变特征:内膜增厚,新生内膜产生;内膜内泡沫细胞聚集;平滑肌细胞增殖迁移至内膜;出现典型的纤维斑块,内含丰富的泡沫细胞、钙沉积且薄纤维帽覆盖表面。对所有突变兔的血脂分析表明血脂升高的程度与LDLR基因和ApoE基因是否为双敲或单敲无关,主要与LDLR基因和ApoE基因的突变所造成的编码蛋白改变有关。结论:利用CRISPR/Cas9基因编辑工具,成功制备了自发性高胆固醇血症LDLR-/-兔模型、LDLR/ApoE双敲兔模型以及ApoE-/-兔模型,为心血管相关疾病的机制研究和防治提供了合适的实验动物模型。
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