论文部分内容阅读
目的:在过去,在研究中枢神经系统(central nervous system,CNS)发育过程中,人们只关注于编码基因组,而忽视了非编码基因组的作用。近年来,研究表明人类基因组可以编码成千上万的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA),主要包括2类功能未知的调节性RNA:microRNA(miRNA)和长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。越来越多的研究表明,各类调节性miRNA及lncRNA分子在CNS的正常发育中具有重要的调控作用。miRNA参与转录后调控,而lncRNA主要通过转录,转录后和表观遗传修饰参与基因的表达调控。脑特异性miRNA或lncRNA异常表达或缺失易造成情绪障碍性疾病,如重度抑郁症、双相情感障碍和精神分裂症。然而,目前对参与神经分化及抑郁症的miRNA或lncRNA具体分子机制尚不完全清楚。本研究旨在研究几个筛选的ncRNA通过调节靶基因表达揭示神经分化的分子机制,并进一步为抑郁症的发生提供新的分子机制。基于以上研究背景,本研究分为两大部分:ncRNA在神经分化及慢性应激模型中的调控作用及相关机制研究。方法:①利用蛋白印迹(western blotting,WB)和实时定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测SOX6及CD44在P19细胞不同分化点的表达。利用染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)和荧光素酶实验研究SOX6与CD44启动子的结合情况。②利用RNA 免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)和荧光索酶实验研究miR-l35a-5p与SOX6之间的关系。并进一步通过过表达及敲减miR-135a-5p或SOX6,研究两者在P19细胞分化中的生物学作用。③利用甲基化DNA免疫沉淀(methylated DNA immunoprecipitation,MeDIP)和ChIP实验研究TGFβ2-AS1在SH-SY5Y细胞分化中的转录活性。通过体外过表达或敲减TGFβ2-ASl,研究TGFβ2-AS1在SH-SY5Y细胞中的增殖及分化作用。④通过 qPCR 和 lncRNA pulldown 实验研究 TGFβ2-AS1 对 SIRT6 mRNA的调节作用。利用免疫沉淀(immunoprecipitation,IP),ChIP和荧光素酶实验研究SIRT6对Neurod6介导miR-135/139转录调控作用。通过miRNA和lncRNA pulldown实验研究miR-135/139与TGFβ2-AS1之间的关系。⑤通过体内体外敲减DPYSL2,研究DPYSL2对抑郁样行为及树突发育等影响。体外IP或免疫共沉淀(CoIP)实验验证DPYSL2与NMDAR及CaMKⅡβ的相互作用。⑥利用qPCR,WB,RIP和荧光素酶实验研究miR-181/410对DPYSL2的调节作用,并通过ChIP和荧光素酶实验研究miR-181/410与CORT受体的相互调节作用。⑦进一步利用MeDIP实验研究DNA甲基化转移酶对DPYSL2转录活性的影响,以及利用ChIP和荧光素酶实验研究了 E2Fl对DPYSL2启动子活性的影响。结果:①与未诱导的细胞相比,在不同分化时间点的P19细胞中SOX6和CD44的mRNA及蛋白水平明显减少。在SOX6过表达细胞中,SOX6明显增加野生型CD44启动子的荧光素酶活性,而对突变型CD44启动子荧光素酶活性无影响。在SOX6缺失HMG结构域的细胞中,Flag-SOX6无法富集出CD44启动子。②miR-135a-5p过表达显著抑制了 SOX6 3’UTR的荧光素酶活性;相反地,miR-135a-5p抑制剂可以增加SOX6 3’UTR的荧光素酶活性。同时,miR-135a-5p过表达可以显著富集出SOX6 3’UTR。功能学研究显示,SOX6高表达于P19细胞,是P19细胞分化负调控因子,而miR-135a-5p是P19细胞分化正调控因子,且两者在树突发育中具有重要的调节作用。③通过lncRNA芯片筛选出在SH-SY5Y细胞分化中具有重要调控作用的反义lncRNA分子TGFβ2-AS1。在SH-SY5Y细胞中过表达或敲减TGFβ2-AS1,TGFβ2-AS1可以使SH-SY5Y细胞的增殖能力增加,而阻止SH-SY5Y细胞的分化。④在TGFβ2-AS1过表达细胞中,外源性TGFβ2-AS1可以降低SIRT6 mRNA和蛋白水平,而在TGFβ2-AS1敲减细胞中,内源性TGFβ2-AS1降低增加了 SIRT6 mRNA和蛋白水平。进一步证实TGFβ2-AS1可以稳定结合到SIRT6的3’UTR区,并介导其mRNA衰变。SIRT6与Neurod6之间可以形成稳定的异源二聚体结构。内源性SIRT6减少及SIRT6 H133Y突变体都可以改变Neurod6介导的荧光素酶转录活性。同时,研究证实SIRT6可以通过去乙酰化H3K56招募Neurod6形成转录激活复合物介导miR-135/139的表达。此外,我们发现TGFβ2-AS1转录本区含有miR-135/139结合位点,miR-135/139过表达可以显著抑制TGFβ2-AS1转录后水平。⑤PFC脑区DPYSL2表达降低易导致小鼠抑郁样行为的易感性增加及相应树突棘密度减少。同时,体外减少DPYSL2表达也可以影响到原代神经元细胞的树突发育。DPYSL2是一种突触后蛋白,可以同时与NMDAR及CaMKⅡβ相互作用,并调控神经元可塑性的生物学效应。⑥miR-181/410可以调控DPYSL2的表达。同时,在慢性应激模型中,miR-181/410与CORT受体形成反馈调节环路并相互活化来控制DPYSL2的表达。⑦在生理及慢性应激状态下,DNA甲基化转移酶活性也可以影响DPYSL2的转录活性。E2F1可以作为抑制性转录因子,调控DPYSL2的表达。结论:(1)本研究证实miR-135a-5p/SOX6/CD44通路在P19细胞分化中具有重要的调控作用。(2)TGFβ2-AS1/SlRT6/Neurod6/miR-135/139 环路在 SH-SY5Y细胞分化中具有关键的调控作用。(3)CORT受体与miR-181/410形成反馈环路在慢性应激模型中调控DPYSL2表达及相关抑郁样表型。总之,通过以上研究,我们证实了 ncRNA在神经分化及慢性应激模型中具有重要调控作用,同时也为我们下一步研究打下了坚实的基础。