目的： 三氧化二砷(Arsenic trioxide，ATO)是治疗以t(15；17)易位引起的PML/RARα融合蛋白为特征的急性早幼粒细胞白血病(APL)最有效的药物之一。ATO以相对低浓度(≤2μM)即可降解PML/RARα融合蛋白并诱导细胞凋亡。ATO对缺乏PML/RARα融合蛋白的许多肿瘤细胞均有抗癌活性，包括急性髓性白血病，淋巴细胞白血病，多发性骨髓瘤以及实体肿瘤等。然而，由于敏感性或耐药性的不同严重阻碍了临床应用。另外，ATO对大部分的实体肿瘤细胞虽然具有杀伤毒性但是敏感性差，而且大多伴随细胞周期的改变，G1期阻滞或G2/M期阻滞。目前对ATO在APL和实体肿瘤中产生不同作用的机制尚不清楚。 Phosphatidylinositol3—kinase(PI3K)/Akt通路被认为是重要的存活信号通路。在多种肿瘤中研究表明PI3K/Akt的失调控可能造成肿瘤形成，转移和对化疗耐药。组成性的或诱导出的p—Akt介导重要底物分子的磷酸化，改变他们的活性从而启动或抑制凋亡。同时，PI3K/Akt信号通路也受到PTEN和Ras等信号分子的调节。 泛素连接酶Casitas B—lineage Lymphoma(Cbl)家族蛋白作为一种PI3K/Akt信号的负调节因子，在一些细胞如T细胞、破骨细胞的功能中起着非常重要的作用[30-33]。Cbl蛋白能够与PI3K的p85亚单位结合，导致PI3K的泛素化和降解[34，35]而改变信号的传导。然而，Cbl蛋白是否通过调控PI3K/Akt信号参与ATO抗癌作用机制还不清楚。 胃癌是当今世界范围内第二位常见的恶性肿瘤。在我国，胃癌是肿瘤死亡的主要原因之一。晚期患者的预后较差，总体疗效不理想。寻找新的合适的药物或合理应用已知药物提高胃癌疗效甚为重要。临床实践证明毒副作用轻、疗效肯定的ATO成为最好的候选药物之一。因此有必要深入研究ATO对APL和胃癌的抗癌作用机制，尤其有必要确定在APL和胃癌中产生差异的确切机制。 为深入研究ATO抗癌机制，本实验首先以急性白血病细胞系NB4和HL60为ATO诱导凋亡模型，研究PI3K/Akt信号通路及泛素连接酶Cbl家族蛋白在此过程中的作用。其次以人胃癌细胞系MGC803，BGC823及SGC7901为模型，研究ATO对胃癌细胞的毒性作用，并研究了PI3K/Akt信号通路以及Cbl蛋白在这一过程中的调节机制。最后，进一步探讨了ATO在NB4和MGC803细胞中产生不同作用结果的分子学机制。 材料与方法： 1、采用台盼蓝拒染法和MTT法测定细胞活力。 2、采用流式细胞仪通过PI染色进行细胞周期解析及凋亡判定。 3、采用Western blot检测Akt、p—Akt、bcl—2、p53、和Cbl—b、c—Cbl蛋白的表达。 4、统计学处理：每次实验重复3次，数据以x±s表示，采用SPSS13.0软件进行t检验和单因素方差分析。 实验结果： 1、ATO抑制细胞增殖 台盼蓝拒染法检测ATO对NB4，HL60细胞活力的影响。ATO以剂量依赖性方式抑制NB4和HL60细胞增殖。抑制细胞增殖50％的药物浓度(IC50)24小时分别1.91μM和4.36μM。MTT法检测ATO对MGC803，BGC823，SGC7901细胞活力的影响。ATO以剂量依赖性方式抑制细胞增殖。抑制细胞增殖50％的药物浓度(IC50)24小时分别23.4μM，25.43μM，27.13μM。提示胃癌细胞对ATO敏感性差。 2、ATO诱导NB4，HL60细胞凋亡，诱导胃癌细胞G2/M期阻滞 流式细胞仪分析显示ATO分别作用NB4，HL60细胞24小时后，以剂量依赖方式增加细胞凋亡，即亚二倍体细胞百分数(细胞凋亡率)增加。ATO分别处理胃癌MGC803，BGC823，SGC7901细胞24小时后，倒置显微镜下观察，发现细胞仍然保持活力，圆而非帖壁的细胞较对照组多见。进一步以流式细胞仪分析，ATO处理胃癌细胞显示显著的G2/M期阻滞，而亚二倍体细胞无显著增加。提示ATO对胃癌细胞MGC803，BGC823，SGC7901的作用不同于ATO对急性早幼粒细胞白血病NB4细胞。 3、ATO对Akt活性的影响 分别以ATO诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞的代表性浓度作用细胞不同的时间后检测磷酸化Akt(p—Akt)和Akt。Western blot解析结果显示，对照组NB4和HL60细胞均表达一定水平的p—Akt。ATO处理4小时后，二种细胞中均p—Akt显著增加，而后逐渐降至本底水平以下。而Akt水平在ATO作用前后没有变化。对照组胃癌细胞中均表达不同程度的p—Akt。在处理4小时后，也出现p—Akt短暂活化，随后降至本底水平以下。用25μM LY294002预处理细胞抑制PI3K/Akt信号传导。结果显示LY294002显著提高了ATO诱导的细胞凋亡百分比(NB4，HL60)。LY294002显著降低了ATO诱导胃癌细胞的G2/M期阻滞，同时显著提高了的细胞凋亡率(MGC803，BGC823，SGC7901)。进一步分析LY294002对p—Akt的影响，一致地显示LY294002预处理的细胞中ATO诱导的p—Akt的短暂活化消失。提示ATO诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞过程中，p—Akt短暂活化为ATO本身的药物特性，并且在ATO抗癌作用中起着重要的调节作用。而p—Akt的最终失活是细胞走向死亡的重要原因。 4、ATO对Cbl蛋白表达的影响 据报道，Cbl为PI3K/Akt信号通路的负性调节因子。本研究检测了Cbl蛋白的表达及其功能。Western blot解析结果显示，ATO显著增加了NB4，HL60细胞中Cbl—b和c—Cbl蛋白表达，从4小时开始上升，至24小时达到平台。ATO也显著增加了胃癌细胞MGC803，BGC823，SGC7901细胞中Cbl—b和c—Cbl蛋白表达。Ps341能够抑制Cbl蛋白功能。10nMPs341预处理4小时后洗去药物，加入ATO分别处理白血病细胞和胃癌细胞。流式细胞分析结果显示Ps341预处理可部分减少ATO诱导细胞凋亡(NB4，HL60)，而增强ATO诱导胃癌细胞G2/M期阻滞(MGC803，BGC823，SGC7901)。提示Cbl具有重要的调节作用。进一步地，Western blot解析结果显示Ps341预处理本身对细胞的p—Akt基础表达水平没有影响。但是，Ps341预处理显著延长了ATO诱导的PI3K/Akt的活化持续时间。提示Cbl抑制了ATO诱导的p—Akt过度活化。上调Cbl蛋白表达可能为ATO最终抑制PI3K/Akt信号通路，继而使细胞走向死亡的作用机制之一。 5、比较ATO诱导NB4细胞凋亡和MGC803细胞G2/M期阻滞过程中，bcl—2蛋白的变化 为了研究ATO诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞产生不同结果的分子学机制，本实验分析了凋亡早期标志物bcl—2蛋白。分别以1μM和10μM ATO处理NB4细胞和MGC803细胞。在NB4细胞中，bcl—2蛋白从4小时开始下降，至24小时显著低于本底水平。然而，在MGC803细胞中，却没有bcl—2蛋白的下降，至16小时开始出现磷酸化bcl—2。这些结果提示MGC803细胞至少在10μM作用24小时以内没有诱导凋亡与未能下调bcl—2蛋白有关。在MGC803细胞中，bcl—2的磷酸化滞后于G2/M期阻滞的出现，提示bcl—2的磷酸化并不是导致G2/M期阻滞的关键性因子。 6、比较ATO诱导凋亡和G2/M期阻滞过程中，p53蛋白的变化 NB4细胞和MGC803细胞表达比较高水平的p53蛋白。10μM ATO处理MGC803细胞4小时开始出现p53蛋白表达显著下降。然而，1μM ATO处理NB4细胞后，p53蛋白却没有显著的改变。PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002显著增加ATO处理的MGC803细胞中p53蛋白的表达，轻度增加NB4细胞p53表达。提示虽然ATO诱导NB4细胞凋亡没有p53的降解，但是短暂活化的PI3K/Akt信号在两种细胞中均抑制了p53蛋白表达。Ps341预处理进一步减少1ATO处理的胃癌细胞中p53蛋白表达，但是NB4细胞中p53却没有明显变化。进一步，在BGC823，SGC7901细胞中也见到与MGC803细胞中相似现象。提示p53功能的最终状态是使细胞发生凋亡还是G2/M期阻滞的关键因子。 结论： 1、ATO抑制急性白血病细胞和胃癌细胞增殖，但是胃癌细胞敏感性最差。 2、ATO诱导NB4，HL60细胞凋亡，胃癌细胞MGC803，BGC823，SGC7901则G2/M期阻滞 3、ATO诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞过程中均伴随短暂活化PI3K/Akt信号。 4、ATO诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞过程中均上调Cbl—b和c—Cbl蛋白，Cbl蛋白抑制PI3K/Akt信号的过度活化 5、ATO诱导NB4细胞凋亡时p53蛋白不变，而ATO诱导胃癌细胞G2/M期阻滞时p53蛋白显著下降，p53蛋白最终状态的不同是ATO产生不同结果的决定性因子。