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文昌鱼是现存与脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎动物类群之一,由于文昌鱼的形体结构及胚胎发育和脊椎动物有许多共同之处,在基因和基因组水平上二者又有很高的同源性,因此文昌鱼是进化和发育生物学等研究的理想材料。近年来,随着文昌鱼实验室连续繁殖获得成功和全基因组测序的完成,极大地推动了文昌鱼模式化进程,以文昌鱼为对象的基因功能研究日益增多,文昌鱼的基因及其表达模式常用于与其他物种,尤其是与脊椎动物之问的比较基因组学和发育生物学研究。
相邻基冈缺失综合征(AMME,Alport syndrome.Mental retardaltion,Midfacehypoplasia and Elliptoeytosis.)是由人X染色体上一段序列缺失所致,Ammecr1是位于该缺失序列片段上的基因之一,但该基因的确切功能尚不清楚。数据库搜索发现在脊椎动物中存在2个Ammecr同源基因:Ammecr1和Ammecr11,而在无脊椎动物和细菌中只有一个同源基因。为了探索这一基因的功能,本研究克隆了文昌鱼中Ammecr同源基因,进而对Ammecr基因家族的进化和文昌鱼Ammecr1基因的表达进行了研究。
文昌鱼的Ammecr1基因(AmphiAmmecr1/11)的cDNA序列全长2,920bp,其中开放阅读框全长为738bp,编码245个氨基酸。将AmphiAmmecr1/11与脊椎动物代表物种人、鸡、爪蟾和斑马鱼以及无脊椎动物海鞘、果蝇和线虫的Ammecr1同源基因进行蛋白序列比对,发现Ammecr基因家族成员序列相似度很高,尤其是C端区域:利用蛋白比对结果构建的系统进化树显示脊椎动物.Ammecr1与Ammecr11亚家族分别聚成两簇,AmphiAmmecr1/11位于这两基因簇的底部,这个结果说明脊椎动物Ammecr1和Ammecr11可能来源于同一个祖先基因,是基因倍增的结果。然而,在目前所有可用的硬骨鱼数据库中都只找到一个Ammecr1基因,设计兼并引物用PCR方法也只在斑马鱼中克隆到Ammecr1基因;由于目前软骨鱼数据库不完整,无法判断软骨鱼基因组中Ammecrl同源基因的数目,本研究又用同样的PCR方法在软骨鱼代表——条纹斑竹鲨中成功地克隆到Ammecr1及Ammecr11,这一结果暗示Ammecr11基因可能在硬骨鱼中发生丢失,而软骨鱼和其它脊椎动物类群中保留了Ammecr1和Ammecr11基因。
为了进一步研究脊椎动物Ammecr1/Ammecr11的起源问题,我们还比较了数据库中代表物种Ammecr1/Ammecr11同源基因的结构,结果显示脊椎动物Ammecr1/Ammecr11在外显子大小和数目(6个外显子)上都相当保守,文昌鱼AmphiAmmecr1/11(5个外显子)和它们也仅有一个外显子之差,且AmphiAmmecr1/11最后一个外显子长度(209bp)恰好与脊椎动物中Ammecr1/Ammecr11最后两个外显子长度之和(212bp)相当,推测脊椎动物Ammecr1和Ammecr11基因的最后两个外显子是由AmphiAmmecr1/11最后一个外显子进化而来。
Ammecr基因分布的广泛性和序列上的高度相似性暗示了其功能上的保守性。为了研究Ammecrl在脊索动物进化过程中是否保留了相同或相似的功能,本实验利用原位杂交和实时荧光定晕PCR方法比较了斑马鱼Ammecr1和文昌鱼AmphiAmmecr1/11在胚胎的表达情况。结果显示,斑马鱼Ammecr1呈现母源表达特征,在卵母细胞和受精卵中有大量基因转录物。同时发现斑马鱼Ammecr1也存在合子表达方式,实时荧光定量PCR结果显示合子表达发生在大约囊胚晚期;24 hpf时期的胚胎的原位杂交结果显示,表达产物集中在整个脑部,48 hpf之后,在咽弓和背鳍原基处也检测到明显信号,该结果说明斑马鱼Ammecr1合子表达具有时空特异性,可能参与到脑、咽弓及背鳍的形成与发育过程中。
文昌鱼AmphiAmmecr1/11原位杂交和实时荧光定量PCR结果同样显示出母源表达特征,但本研究中尚未发现其合子表达,这可能说明Ammecr1是在脊索动物进化过程中获得的新的表达方式(合子表达),至于合子表达产物是否与母源表达产物行使相同的功能,有待进一步研究。